基于SLM技术的表面多孔钛金属多根牙种植体的骨结合研究

游 嘉 方利华 张 青 高亦林 彭 伟

1(浙江工业大学特种装备制造与先进加工技术教育部/浙江省重点实验室, 杭州 310032)2(湖州市中心医院口腔科, 浙江 湖州 313000)

基于SLM技术的表面多孔钛金属多根牙种植体的骨结合研究

游 嘉1方利华2*张 青2高亦林1彭 伟1

1(浙江工业大学特种装备制造与先进加工技术教育部/浙江省重点实验室, 杭州 310032)2(湖州市中心医院口腔科, 浙江 湖州 313000)

为研制具有良好骨结合特性的多根牙种植体表面结构，利用有限元方法优化设计一种三维连通多孔结构，采用选择性激光熔化(SLM)3D打印技术实现了钛金属多根牙种植体及其表面三维连通多孔结构的制造。采用市售可吸收介质喷砂(RBM)表面处理的种植体作为对照组，在18只新西兰大白兔后肢胫骨上做同体对照植入实验，并分别于术后4、8、12周获取种植体-骨组织标本。通过微CT扫描标本，统计分析实验组和对照组的BV/TV值；同时制作硬组织切片，甲苯胺蓝染色观察种植体周围骨形成的情况。实验结果显示：4周时可见实验组的BV/TV已高于对照组，12周时BV/TV值显著高于对照组(P<0.05)，最高值达到47.83%。由拟合的曲线可见实验组的新增骨量在12周后的增长趋势强于对照组。硬组织切片观察发现，4周时骨组织开始长入至种植体表面孔隙中，8周时双根分叉区域内可以观察到骨组织。同期对照可见新增骨组织的致密性也高于对照组。结果表明：采用SLM3D打印技术加工的、表面具有三维连通多孔结构的多根牙种植体成骨效能优于市售RBM表面处理的种植体，具有临床应用前景。

多根种植体；SLM技术；孔隙结构；骨结合；微CT

引言

种植义齿与传统固定、可摘义齿相比有着美观，舒适，耐用，不损伤邻牙等优点，已成为牙列缺失患者的主要选择[1-3]。但是，磨牙区在近远中方向的间隙较大，若伴有牙槽骨颊舌向较窄或垂直骨量不足时，单颗种植体往往不能取得良好的修复效果，有时还会出现种植体断裂的机械并发症[4-5]。因此，有学者提出采用两颗小直径的种植体来支持单颗义齿的修复方法[6-7]。但是，该方法会增加患者的医疗费用，对种植体之间的平行度和距离有较高的要求，如果距离控制不当会影响修复体的制作和清洁[8-9]。另外，小直径的种植体会增加植体颈部与骨组织之间的应力值，容易导致骨吸收[10]。

近年来，随着RP技术的发展，出现了选择性激光熔化技术(selective laser melting，SLM)，利用超高能量激光束将金属粉末完全熔化，层层堆积增量，最终得到计算机辅助设计(computer aided design，CAD)模型的金属成品[11]。由于能够对医用金属粉末进行熔融烧结，获得有利于骨结合的粗糙表面，在口腔领域中SLM技术已经开始运用于牙冠内冠、个性化基台和个性化植入体的加工制造[11-14]。孔隙率和孔隙大小对骨生长有很大的影响[15]，拥有孔隙结构的植入体更具骨引导的特性，特别是具有相互连通的孔隙结构，可以使骨组织与植入体之间相互交织，增加固位力[16]。有学者就利用SLM技术加工成型多孔的钛金属组织工程支架[17]。

根据前期研究成果[18]，提出一种表面与皮质骨和松质骨的孔隙率相匹配，且孔隙内部三维连通的多根牙种植体。利用SLM技术实现了多根牙种植体及其表面的制造，采用新西兰大白兔胫骨的同体植入对照实验方法，运用微CT扫描及组织切片等技术对种植体周围骨量及组织形态进行分析，为未来多根牙种植体的临床应用提供基础。

1 材料和方法

1.1表面多孔钛金属多根牙种植体的制备

1.1.1多根牙种植体的设计

在前期研究的基础上，设计了多根牙种植体的几何参数：全长为8.5 mm，宽度为8.3 mm，厚为3.3 mm，根分叉处的水平距离为1.8 mm，根底部的直径为2.5 mm，为了考虑种植体的整体强度，表面的孔隙厚度设为0.8 mm。整体尺寸及剖面图如图1所示。

图1 多根牙种植体的CAD模型。(a)整体尺寸；(b)剖面图Fig.1 Multi-roots dental implant CAD model. (a)Overall dimensions; (b)Implant cross-section with pore structure

减少种植体与骨组织接触部分的“应力遮蔽”是表面设计的重要内容，通过孔隙的设计可以有效降低种植体的刚度而减少“应力遮蔽”的产生[17]。因此，对多根牙种植体表面的孔隙结构进行设计。根据皮质骨和松质骨的孔隙率，选择孔隙率为26%的结构单元组成多根牙种植体表面的皮质骨区，孔隙率为50%的结构单元组成多根牙种植体表面的松质骨区。为了使骨组织能够长入到孔隙中，结构单元的孔隙大小参考皮质骨中的骨单位及松质骨骨小梁的直径，分别选择300和400 μm[19-20]，设计的结构单元如图2所示。两种孔隙率的结构单元在多根牙种植体上的分布如图1(b)所示，具体尺寸信息如表1所示。

1.1.2多根牙种植体的SLM制造

本研究采用的SLM加工设备为Renishaw公司的AM250，使用平均粒径为30 μm的Ti6Al4V金属粉末在氩气环境中进行熔融烧结。激光光斑的直径为70 μm，每层的铺粉厚度为50 μm。扫描的参数为：扫描速度为0.6 m/s，激光功率200 W，曝光时间为125 μs。加工完成后用金刚玉喷砂去除表面多余的粉末，并在25℃的蒸馏水中用超声波震荡清洗25 min，然后在80℃的NaOH (20g/L)溶液和双氧水(20 g/L)中各浸泡30 min，最后在蒸馏水中超声波震荡5 min[21]。包装消毒后备用。

1.2实验动物及分组

健康新西兰大白兔18只，体重为3.0～3.5 kg，雌雄不限，由浙江省实验动物中心提供。每只兔子的双侧后肢胫骨随机取一侧作为实验组，植入本研究的多根牙种植体，另一侧植入尺寸为4.0 mm×10 mm，RBM表面处理的商用钛金属种植体作为对照组。实验分别设置4、8、12周3个观察时间点，每个时间点有6只兔子参与实验。全部实验动物在(22±2)℃和70%相对湿度环境饲养。

图2 模拟皮质骨和松质骨孔隙率的结构单元。(a)模拟皮质骨26%孔隙率，300 μm边长的正方形孔隙结构单元；(b)模拟松质骨50%孔隙率，400 μm边长的正方形孔隙结构单元Fig.2 Structure cell with different porosity. (a)Square pore cell with 300 μm length of side and 26% porosity to mimic cortical bone; (b)Square pore cell with 400 μm length of side and 50% porosity to mimic cancellous bone

区域孔隙率%孔隙大小/μm厚度/mm高度/mm皮质骨263000.83松质骨504000.85.5

1.3实验方法

1.3.1多根牙种植体表面的形态观察

多根牙种植体的表面形态用体视显微镜(Leica, 德国)观察，孔隙结构用扫描电镜(HITACHI, 日本)观察。

1.3.2有限元方法分析结构单元的力学性能

结构单元的整体材料属性：泊松比取0.3，相对弹性模量可以通过式(1)来计算得到：Ti6Al4V的弹性模量为114 GPa[22]，则26%的孔隙率的结构单元的相对弹性模量为62.4 GPa，50%的孔隙率的结构单元的相对弹性模量为28.5 GPa。

(1)

式中,E*是结构单元的相对弹性模量，E是钛金属的弹性模量，φ是孔隙率。

对图2两种孔隙率的结构单元施加如图3(a)所示的约束和载荷：对S1面进行完全约束，在S2上施加20 MPa的应力[23]，利用有限元分析软件(Abaqus, 法国)对结构单元的应力应变进行分析。

1.3.3动物模型的手术实施

用1%巴比妥钠(2 mL/kg)经兔耳缘静脉注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定，双侧后肢膝关节区备皮。用2%碘酊及75%酒精局部皮肤消毒，铺巾。局部用2%利多卡因浸润麻醉，依次切开膝关节区胫骨近心端内侧皮肤、筋膜和骨膜，剥离骨膜暴露骨面，在生理盐水充分冷却下以1 000 r/min采用逐级备孔的方式备孔至所需深度和直径，将经过可吸收介质喷砂(RBM)表面处理的种植体植入胫骨近心端，平齐骨面。另一侧利用导板引导备孔，按压式植入多根牙种植体，最后分层缝合。术后不进行石膏固定处理；手术后给予动物肌注抗生素(庆大霉素，8万U/d)5 d。

1.3.4标本采集和检测

分别于术后4、8、12周在兔耳缘静脉注射过量巴比妥处死动物，取出带种植体的胫骨用甲醛固定，用于微CT扫描和组织切片观察。

1.3.5微CT扫描分析

用金刚砂砂轮修整样品至4 cm长，然后放入Micro-CT (SKYSCAN 1076, 比利时)扫描仓内扫描，扫描参数设定为：电压70 kV，电流100 μA，扫描层厚18 μm。扫描完成后用软件(Skyscan Ant, 比利时)进行三维重建，提取种植体周边的感兴趣区域(Region of Interest ROI)对相对骨体积分数(BV/TV)进行统计分析。

1.3.6组织形态光镜观察

含种植体的骨块用金刚砂切片截成约2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm的组织块。甲醛固定一周后，经脱水、渗透、包埋后采用Leica1600型硬组织切片机沿着植体的长轴纵切，制成厚度为4 μm的切片。再用甲苯胺蓝染色，48 h后进行封片，利用光学显微镜(Nikon, 日本)观察种植体骨质生成情况和种植体骨结合情况。

2 结果

2.1多根牙种植体表面的形态特征

图4(a)显示了采用SLM技术加工得到的多根牙种植体。种植体表面的皮质骨和松质骨区具有不同大小的孔隙结构，孔隙结构的内部是连通的。孔的大小和结构通过SEM的观察如图4(b)和图4(c)所示。皮质骨区的孔隙大小约为290 μm，松质骨区的大小约为390 μm。

2.2有限元分析结果

根据Frost的骨力学调控机制理论，当骨组织受到的应变≤2×10-4时将产生废用性吸收，骨量减少；当应变在≥10-3时骨组织开始进行塑建，骨量增加[23]。从分析的结果来看在20 MPa的应力下，50%孔隙率的结构单元能够产生最大2.6×10-3的应变(见图3(b))，而26%孔隙率的结构单元最大的应变为8.5×10-4(见图3(c))。两个孔隙结构单元的最大应力集中在孔的顶角处。图3(b)显示模拟松质骨孔隙率的结构单元产生10-3应变以上的区域主要集中在单元三分之一棱边以下，该区域的应力值在130 MPa左右(见图3(d))。模拟皮质骨孔隙率的结构单元产生2×10-4应变以上的区域主要集中在三分之二棱边以下及孔隙的周边，且这部分的应力值在50 MPa以下，如图3(e)所示。

2.3术后动物大体观察

所有动物1～2 d内恢复正常饮食，术后1周内恢复正常活动。全部动物均未见死亡，伤口无感染、红肿及开裂等不良反应，伤口均I期愈合。各时间点取材可见植入的种植体与骨组织之间无缝隙，种植体无松动脱落现象。

2.4微CT扫描结果

微CT能够很好的分辨兔子腿骨组织内部的细微结构，并可以量化分析种植体周边的骨重建情况[24]。对4、8、12周的RBM种植体和多根牙种植体的骨体积(bone volume, BV)和总体积(total volume, TV)的比值BV/TV进行了测量，用SPSS19.0软件进行分析，得到如图5的拟合曲线，显著性P<0.05。RBM种植体BV/TV的平均值从4周时的21.57%增长到12周时的38.56%，而多根牙种植体BV/TV的平均值从4周时的24.58%增长到12周时的45.9%，多根牙种植体在4、8和12周时的BV/TV值都要比RBM种植体的高，且每个时间点的多根牙种植体和RBM种植体的BV/TV值之间有显著差异(见表2)。

表2多根牙种植体(n=6)和RBM种植体(n=6)的BV/TV均值

Tab.2BV/TVvalueofMulti-rootsdentalimplants(n=6)andRBMdentalimplants(n=6)

植入时间/周组别BV/TVP4多根牙种植体RBM种植体24.58±0.7621.57±0.64<0.058多根牙种植体RBM种植体39.37±0.4932.15±0.48<0.0512多根牙种植体RBM种植体45.90±0.8138.56±0.34<0.05

图4 SLM加工得到多根牙种植体实物。(a)多根牙的整体形状；(b)颈部区域的SEM扫描图，图中孔隙大小约为290 μm；(c)根部区域的SEM扫描图，图中孔隙大小约为390 μmFig.4 Multi-roots dental implant fabricated by SLM technique. (a)Overall profile of MRI; (b)SEM image for neck region of MRI, the dimension of pore structure is about 290 μm; (c)SEM image for root region of MRI, the dimension of pore structure is about 390 μm

2.5组织形态学观察

植入4、8、12周后进行组织切片，采用甲苯胺蓝染色观察显示，实验组和对照组的植体窝洞内没有发现炎症反应及骨坏死现象，新生骨显示为深蓝色，原矿化骨为淡紫色。从第4周到第12周末多根牙种植体和RBM种植体周围的骨组织都成增加趋势(见图6和图7)。第4周的时候就可在多根牙种植体的孔隙中观察到骨组织(见图7(a))，在第8周的时候可以看到多根牙的根分叉处及根分叉颈部有新骨形成(见图8)。

3 讨论

为了使种植体能够具备较好的骨传导能力，种植体的表面需要具备三维连通的孔隙结构，而且孔隙的大小需要保持在200～500 μm[16-17]，而孔隙结构的形状对骨长入的影响要小得多[25]。SLM技术可以很好的控制加工精度，能够保证孔隙结构不会产生严重变形，从而保证了孔隙的大小[25]。本文设计的是300和400 μm的孔隙，而实际加工出来的孔隙尺寸减少了10 μm左右，误差范围在2.5%～3%之间，对骨结合的影响可以忽略。从图4(a)可以看出，所设计的表面孔隙具有三维连通的特性。

“应力遮蔽”会导致骨吸收，对骨结合的远期效果会产生影响[14]，在设计的时候要尽量避免，另外，种植体在外力作用下产生的应力过小会使骨组织产生废用性吸收，而过大会加速骨组织的吸收[27]。从图6(a)可以看出，在植入RBM种植体时通过扭力获得初期稳定性，强大的应力会破坏骨组织的结构，使螺纹面处的骨组织产生了吸收。本课题采用正菱形作为孔隙形状，根据松质骨和皮质骨的孔隙率来设计结构单元。其中，松质骨结构单元能够有效降低弹性模量，而皮质骨结构单元的弹性模量降低的效果要小，有限元的分析结果显示松质骨的应变要大于皮质骨，且两者的应变主要集中在结构单元的棱边区域，说明该孔隙结构有利于应力向骨组织的传递，避免“应力遮蔽”的产生。两种单元在棱边上的应力显著降低，特别是皮质骨区可以有效避免颈部的应力集中。从分析的结果来看，孔隙率越大弹性模量越低，产生的应变也越大，同时应力值也越大，所以孔隙率的选择需要考虑弹性模量、应变和应力之间的相互协调。

图5 多根种植体和RBM种植体4、8、12周的BV/TV拟合曲线Fig.5 BV/TV fitting curve at 4, 8 and 12 weeks of Multi-roots dental implant and RBM dental implant.

图6 RBM种植体的甲苯胺蓝染色切片。(a)4周时的切片；(b)8周时的切片；(c)12周时的切片Fig.6 Histological section of RBM dental implants with toluidine blue staining. (a)Section of 4 weeks after operation; (b)Section of 8 weeks after operation; (c)Section of 12 weeks after operation

孔隙空间有利于氧和营养物质的转移，而互通的孔隙在加速血管化的同时提高细胞的分化率，有利于细胞的增殖[28-29]。图5的拟合曲线显示：4周时多根牙的BV/TV值就高于RBM种植体，到达12周时RBM表面的BV/TV的曲线形态趋于平稳，而多根牙种植体的曲线形态还要往上发展，说明骨组织在不断地增加。结合组织切片图7(a)可知，在第4周的时候骨组织已经长入到多根牙种植体的孔隙及连通区域中，到了第8周时孔隙及连通区域内的骨组织明显增多(图7(a)和图7(b)中箭头所指处)。在第12周的时候孔隙中的骨组织和多根牙种植体产生了很好的骨结合(图7(c))。从图7(a)与图6(a)的对比可看出多根牙种植体表面的早期骨结合性能要优于RBM种植体。这是因为多根牙种植体在植入时没有对骨组织产生很大的压应力，且种植体与窝洞间的空隙含有丰富的血凝块，在骨髓腔微循环产生的微力刺激下更易发生骨结合。

两个相邻种植体之间的距离并没有明确的结论，但是种植体和邻牙之间的距离一般建议不少于1.25 mm，为了考虑种植体能够保证长期稳定，有学者提出种植体周围要保留0.5 mm的骨壁[30]。本设计的根分叉处距离为1.8 mm，从图8(a)中可以看出第8周时骨组织已经在两根之间生长，图8(c)显示在12周时根分叉的颈部已有骨组织形成，说明所设计的根分叉距离不影响骨组织的生长，而且SLM加工的表面具有良好的骨引导性能。

图7 多根牙种植体的甲苯胺蓝染色切片。(a)4周时的切片；(b)8周时的切片；(c)12周时的切片Fig.7 Histological section of multi-roots dental implants with toluidine blue staining. (a)Section of 4 weeks after operation; (b)Section of 8 weeks after operation; (c)Section of 12 weeks after operation

图8 多根牙种植体根分叉处的骨生长情况。(a)8周时两根之间的局部组织切片图；(b)8周时的微CT截面图；(c)12周时根分叉颈部的组织切片图Fig.8 Bone growthbetween root furcation of multi-roots dental implant. (a)Histological section of 8 weeks after operation shows the bone growth between roots area; (b)2D Micro-CT image of 8 weeks after operation; (c)Histological section of 12 weeks after operation shows the bone growth at root furcation

4 结论

本研究通过模拟皮质骨和松质骨的孔隙率设计了表面具有三维连通孔隙结构的多根牙种植体，利用SLM技术加工出多根牙种植体的实物，并通过动物实验证实其具有良好的骨结合性能。多根牙种植体骨结合的长期稳定性以及在根分叉处的骨结合情况有待于在其负重条件下进行跟踪研究。

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Osseointegration of Multi-Roots Ti6Al4V Implant with Porous Surface Based on SLM Technology

You Jia1Fang Lihua2*Zhang Qing2Gao Yilin1Peng Wei1

1(Key Laboratory of E&M, Ministry of Education & Zhejiang Province，Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China)2(Department of Stomatology, Huzhou Central Hospital, Huzhou 313000, Zhejiang, China)

The present study was to develop a multi-roots dental implant (MRI) surface structure with fine osseointegration characteristics. Finite element method (FEM) was used to optimize a kind of connected pore structure; selective laser melting (SLM) technology was utilized to manufacture the MRIs. Eighteen New Zealand white rabbits were used in this study. Eighteen MRIs and 18 commercial implants with resorble blast media (RBM) treated surface were inserted into the left and right hind limb at proximal tibias. At the time point of 4, 8 and 12 weeks the rabbits were sacrificed and bone tissues with implant were collected. All specimens were scanned by micro-CT and then BV/TV values of two groups were obtained. After that the specimens were processed for undecalcified ground sectioning and stained by toluidine blue to observe bone formation around implant. The BV/TV value of experimental group was higher than the control group at the end of 4 weeks, and at the end of 12 weeks the value was significantly higher than control group (P < 0.05), the peak value was elevated up to 47.83%. From the fitting curve of BV/TV value, bone mass around at MRIs were still increasing at the end of 12 weeks, while the control group had achieved a balance. Histological evaluations revealed that bone surround the MRIs were denser than those of RBM implants. At the end of 4 weeks bone tissue had grew into pore structures, and at the end of 8 weeks bone tissue were observed in the root bifurcating area. In conclusion, the multi-roots dental implant with three-dimensional connected pore structure surface manufactured by SLM technology enhance its initial stability, which is of great clinical value owe to its better osteogenic characteristics.

multi-roots implant;SLM technique; porous structure; osseointegration; micro-CT

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.008

2014-10-08， 录用日期:2014-12-11

浙江省科技厅项目(2014C33136)；浙江省卫生厅项目(2014KYA204)

R318

A

0258-8021(2015) 03-0315-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:yjmp8745@126.com