脊髓小胶质细胞P2X4受体在rrTNF诱导的病理性疼痛中的作用*

宫庆娟， 汪红华， 梁 颖， 卢振和， 陈金生， 黄乔东， 越 宇

(广州医科大学附属第二医院疼痛科，广东广州 510260)

坐骨神经周围给予重组大鼠肿瘤坏死因子α(recombinant rat TNF-α，rrTNF)可引起大鼠后爪机械性痛阈下降和热痛反应增强［1］，rrTNF在体内半衰期只有十几分钟，却可引起大鼠持续约20 d的病理性疼痛，其具体的机制仍不清楚。已有研究显示，TNF-α通过小胶质细胞系统介导神经病理性疼痛［2］。大量研究发现，脊髓背角小胶质细胞的P2X4受体在神经病理性疼痛和吗啡耐受中发挥重要作用［3-6］;而且我们以前的研究发现，脊髓表面应用ATP，ATP通过上调小胶质细胞P2X4受体的表达，诱导C纤维诱发电位的长时程增强(long-term potentiation，LTP)［7］，脊髓背角 LTP 被认为是病理性疼痛的神经基础［8］。因此我们设想P2X4受体同样参与坐骨神经周围给予rrTNF引起的大鼠病理性疼痛。

材料和方法

1 实验动物

实验采用成年雄性SD大鼠(180～200 g)，清洁级标准，由省动物实验中心提供。动物分笼饲养，自由饮食，室温保持在(24±1)℃和50～60%的湿度，所有实验步骤都尽量减轻动物的痛苦并按照有关实验动物的使用原则操作。

行为学测试大鼠分为生理盐水(NS)组、TNPATP和PPADS组。Western blot实验大鼠分为rrTNF 100 ng/L 组(3 d、7 d、14 d)、溶剂组(0.1%牛血清白蛋白即0.1%BSA)和naive对照组以及NS组、TNPATP和PPADS组。

2 药物和试剂

rrTNF(R＆D)以10 mg/L的浓度保存在－80℃，给药前立即用含有0.1%BSA的生理盐水稀释为100 ng/L。TNP-ATP［2’，3’-O-(2，4，6-trinitrophenyl)adenosine 5-triphosphate］和 PPADS(pyridoxal phosphate 6-azophenyl-2’，4’-disulphonic acid)购于Sigma。TNP-ATP和PPADS先用双蒸水溶解成储存液，在临用前用生理盐水分别稀释成所需要的浓度。

3 方法

3.1 PST模型的制备——坐骨神经周围植管与给药 参照Wei［1］的方法制备埋置在坐骨神经周围的植管。将明胶海绵切成15 mm×5 mm×9 mm的块状。其中一端被分成两半并插入一根4 cm长的PE-10管，并用线将 PE-10管与明胶海绵固定在一起。70%乙醇浸泡15 min，无菌超净台吹干备用。用10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg，ip)大鼠，然后于左后肢备皮，碘酒及酒精局部消毒。将上述装置中的明胶海绵包裹在分离好的左侧坐骨神经上，通过PE-10管注入200 μL、100 ng/L的 rrTNF 或0.1%BSA。每天1次，共2 d。

3.2 鞘内置管与给药 TNP-ATP和PPADS用生理盐水分别溶解至23.7 g/L和30 g/L。大鼠消毒，暴露出L6棘突，用1 mL注射器针头在L5/L6椎间隙刺入蛛网膜下腔，可看到大鼠甩尾，同时左手将PE-10管用眼科弯镊持住沿小口进入，向前1 cm即可，此时可看到清亮脑脊液出来，固定好PE-10管，缝皮，单笼饲养，等大鼠恢复一段时间后再通过PE-10管注入TNP-ATP或PPADS，每次注射10 μL，连续注射7 d。前2次给予TNP-ATP或PPADS 10 min后再在坐骨神经周围给予rrTNF。

3.3 Westen blot实验 如我们以前文章［9］所述的方法进行，首先分离大鼠L4～L6段脊髓，取给药同侧脊髓背角，分别按重量加入 Tris裂解缓冲液(0.1%SDS，1%NP-40，1 μmol/L OA，0.02%NaN3，10 mmol/L EGTA，0.2 g/L trypsin inhibitor，1 mmol/L NaVO4，1 mmol/L PMSF，protease inhibitor cocktail tablet)，低温匀浆，超声破碎。12 000 r/min低温离心，取上清液。用Micro-BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品加入6 μL上样缓冲液，混匀后，沸水煮沸10 min。SDS-PAGE分离蛋白，200 V电泳45 min，后100 V、1 h转至PVDF膜上，室温封闭 1 h，孵育抗 P2X4受体抗体(1∶500，Alomone)或抗TNF-α 抗体(1∶1 000，Abcam)4℃ 过夜 ，漂洗3次，用辣根过氧化物酶标记的II抗孵育1 h，漂洗3次，ECL显色1～3 min，曝光。计算机行灰度扫描，定量分析。

3.4 免疫荧光染色 坐骨神经周围给予rrTNF后7 d的大鼠，首先灌注300 mL生理盐水，然后灌注350 mL冷的含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB)。取出 L4～L5脊髓，后固定3 h，随后转入30%蔗糖中4℃ 2 d。在冰冻切片机(Leica CM3050S)进行脊髓横切面的切片(25 μm)，如文献［6］所述的方法进行荧光染色。简言之，切片用含3%驴血清0.3%Triton室温封闭1 h，孵育抗P2X4受体抗体(1∶100)、神经元标志物神经元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)抗体(1∶500;Chemicon)、星形胶质细胞标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(1∶500;Chemicon)和小胶质细胞标志物 Iba-1(1∶500;Serotec)的混合液4℃过夜，然后加入FITC和Cy3标记的2种II抗(1∶200;Jackson)，室温下反应1 h。染色的切片于Olympus IX71(Olympus)荧光显微镜下观察并用CCD相机拍照。

3.5 50%机械刺激撤足阈值的测定 为了使大鼠熟悉并适应测试环境，消除大鼠心理因素对测试结果的影响，将大鼠放置于测试的有机玻璃箱内约10 min，待大鼠安静后，采用 Up-Down 方法［1］，选 8 根强度呈对数递增方式的 von Frey hair(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51 和 15.14 g)分别对大鼠后肢左右脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6～8 s。以2.04 g刺激强度为初始刺激强度，若撤足反应为阴性，则选用刺激强度呈对数递增的相邻von Frey hair继续刺激;若撤足反应为阳性，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激。

4 统计学处理

统计检验用SPSS 17.0处理。所有的数据以均数±标准误(mean±SEM)表示。行为学测试结果采用非参数检验进行分析，同一组大鼠不同测试时点的数据先用Friedman ANOVA检验差异，然后再用两组相关数据的秩和检验分析。Western blot结果用凝胶图像处理系统分析目标条带的净吸光度值，使用单因素方差分析进行统计分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 坐骨神经周围给予rrTNF-α后同侧脊髓背角小胶质细胞P2X4受体的表达水平明显升高

已有证据表明P2X4受体是神经病理性疼痛的一个关键分子［3-5］，因此我们检测坐骨神经周围给予rrTNF后脊髓背角P2X4受体的表达是否增加。结果显示，与naive组或vehicle组相比，坐骨神经周围给予rrTNF后3 d、7 d和14 d同侧脊髓背角P2X4受体的表达明显上调，见图1。为了确定激活的P2X4受体在哪种细胞表达，在坐骨神经周围给予rrTNF后7 d进行免疫荧光双染，发现P2X4受体仅与Iba-1存在共染，与GFAP或NeuN不存在共染，表明坐骨神经周围给予rrTNF后同侧脊髓背角小胶质细胞而不是星形胶质细胞或神经元的P2X4受体的表达水平明显升高，见图2。

Figure 1.The expression of P2X4receptor in the spinal dorsal horn significantly increased after peri-sciatic administration of rrTNF(PST).Mean±SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs naive group.图1 坐骨神经周围给予rrTNF后脊髓背角P2X4受体的表达水平明显升高

Figure 2.P2X4receptor was co-localized only with microglia in spinal dorsal horn after peri-sciatic administration of rrTNF.图2 坐骨神经周围给予rrTNF后P2X4受体在脊髓背角小胶质细胞表达

2 阻断P2X4受体抑制坐骨神经周围给予rrTNF诱导的机械痛敏

为了评价P2X4受体在坐骨神经周围给予rrTNF诱导的机械痛敏中的作用，在坐骨神经周围给予rrTNF的大鼠前鞘内应用给予2种P2X受体拮抗剂，一种是 TNP-ATP，P2X 受体1、2、3、4 亚型的拮抗剂;另一种是 PPADS，P2X 受体1、2、3、5、7 亚型的拮抗剂。结果发现TNP-ATP阻断坐骨神经周围给予rrTNF诱导的机械痛敏，而PPADS则不能。这表明P2X4受体可能在坐骨神经周围给予rrTNF诱导的机械痛敏中起重要作用，见图3。

3 阻断P2X4受体抑制坐骨神经周围给予rrTNF引起的脊髓背角TNF-α的上调

以前的研究发现，坐骨神经周围给予rrTNF可引起脊髓背角TNF-α的上调［1］，那P2X4受体是否在坐骨神经周围给予rrTNF诱导的脊髓背角TNF-α的上调中发挥作用，因此我们也观察了在坐骨神经周围给予rrTNF的大鼠前鞘内应用TNP-ATP和PPADS后脊髓背角TNF-α的表达情况。结果发现，与对照组(鞘内应用NS)相比，TNP-ATP明显抑制脊髓背角TNF-α的上调，而PPADS则不能。这表明P2X4受体可能通过上调脊髓背角的TNF-α在坐骨神经周围给予rrTNF引起的机械痛敏中发挥重要作用，见图4。

Figure 3.The effects of P2X4receptor on mechanical allodynia induced by peri-sciatic administration of rrTNF.The intrathecal injection of TNP-ATP completely blocked the mechanical allodynia throughout the course of the tests，whereas the intrathecal injection of PPADS in the same way did not.Upward and downward arrows indicate the time of rrTNF and drug administration，respectively.Mean±SEM.n=8.*P＜0.05 vs baseline(－1 d).图3 P2X4受体在坐骨神经周围给予rrTNF引起的机械痛敏中的作用

Figure 4.Blockage of P2X4receptor inhibited the upregulation of TNF-α induced by peri-sciatic administration of rrTNF in the spinal dorsal horn.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS.图4 阻断P2X4受体抑制坐骨神经周围给予rrTNF诱导的脊髓背角TNF-α的上调

讨 论

目前的研究发现坐骨神经周围给予rrTNF后同侧脊髓背角P2X4受体的表达水平明显升高，P2X4受体仅位于脊髓小胶质细胞。鞘内应用TNP-ATP可抑制坐骨神经周围给予rrTNF诱导的机械痛敏和脊髓背角TNF-α的上调。这些结果表明坐骨神经周围给予rrTNF后，通过小胶质细胞的P2X4受体使脊髓背角的TNF-α表达增加，这样形成一个正反馈，引起大鼠后爪长达20 d的机械性痛阈下降和热痛反应增强。

Tsuda等［3］发现:神经损伤后1 d，小胶质细胞内的P2X4受体上调;鞘内应用P2X4受体的反义寡核苷酸抑制受体的上调和神经损伤后的触诱发痛。我们以前的结果显示，ATP通过上调小胶质细胞P2X4受体的表达诱导脊髓背角的LTP［6］。目前的研究也取得类似结果，这表明神经损伤或坐骨神经周围给予rrTNF后，胞外ATP可能释放增加，作用于P2X4受体，从而增强脊髓背角的突触传递，产生神经病理性疼痛。

TNF-α作为神经损伤和炎症过程中最重要和最早释放的致炎细胞因子，在神经纤维Wallerian变性和神经病理性疼痛的产生过程发挥重要作用［10］。在多种神经损伤引起病理性疼痛的动物模型中，TNF-α在脊髓背角和背根节的表达明显升高，抑制TNF-α的合成或拮抗其受体可减轻神经病理性疼痛［2］。足底注射、皮下注射、坐骨神经内注射TNF-α均能够诱导大鼠神经病理性疼痛症状［11-13］。我们目前的结果发现，坐骨神经周围给予rrTNF可诱导大鼠机械痛敏和脊髓背角TNF-α的上调，P2X4受体参与此过程。Li等［14］的研究发现，缺氧诱导致炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)的表达可被 TNP-ATP 所抑制，这表明P2X4受体可诱导致炎细胞因子的产生。我们最近的研究［15］发现坐骨神经周围给予rrTNF可激活脊髓背角小胶质细胞的SFKs和p38，并通过SFKs/p38信号通路引起脊髓背角TNF-α的上调。因此，我们推测坐骨神经周围给予rrTNF后，可能引起脊髓背角小胶质细胞P2X4受体的表达增加，P2X4受体通过小胶质细胞SFKs/p38信号通路使脊髓背角TNF-α的表达增加诱导大鼠产生机械痛敏。

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