油樟叶总黄酮含量测定及其抗油脂氧化活性

杜永华　敖光辉　魏琴等

摘要： 采用双波长分光光度法和单波长分光光度法测定油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]叶中总黄酮含量，采用烘箱贮藏法测定油樟叶总黄酮对猪油、菜籽油的抗氧化活性。结果表明，双波长分光光度法、单波长分光光度法均可用于油樟叶总黄酮含量的测定，双波长法的稳定性、精密度、重现性、回收率更好，双波长法测得脱脂油樟叶中总黄酮含量为19 21 mg/g。油樟叶总黄酮对猪油和菜籽油均具有一定的抗氧化活性，且呈浓度依赖性。

关键词： 油樟；黄酮；双波长分光光度法；抗油脂氧化

中图分类号： R284 1；O657 32 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0308-03

油樟[Cinnamomum longepaniculatum （Gamble） N Chao]属樟科樟属香料植物，为中国特有树种 ，主产于四川省宜宾市，其叶富含芳香油，已成为香料、医药、日用、化工产品的重要原料来源 [1-2]。目前对油樟叶资源的开发利用主要以提取芳香油为主，对提取芳香油后残渣的开发利用较少，每年有大量废叶残渣被随意抛弃，不仅浪费资源，而且破坏生态平衡 [3]。油樟叶提取芳香油后的残渣具有多种生物活性，如抗微生物 [3]、抗癌 [4]、抗炎 [5]、镇痛 [6]等。目前对提取芳香油后油樟叶渣的化学成分未见报道。黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗炎、镇痛、护肝、抗菌、抗病毒、防止动脉硬化等多种生物活性，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域 [7]。黄酮类化合物在抗油脂氧化方面有显著效果，从植物中提取安全、天然的黄酮类物质以取代人工合成抗氧化剂是油脂或含油食品添加剂的发展趋势 [8-9]。本研究利用双波长分光光度法测定油樟叶总黄酮含量，采用烘箱贮藏法测定其抗油脂氧化活性，旨在为综合开发利用油樟资源提供依据。

1 材料与方法

1 1 材料

油樟叶采自四川省宜宾市翠屏区邱场乡油樟种植基地。芸香苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100080—200707）；猪油（新鲜猪板油经高温湿法熬炼制备）、菜籽油（市售现场压榨）均不含任何添加剂；其他化学试剂均为分析纯。AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LG-5A 真空冷冻干燥机（上海市离心机机械研究所有限公司）；HH4数显恒温水浴锅（金坛市正基仪器有限公司）。

1 2 方法

1 2 1 油樟叶总黄酮的提取 将油樟叶用水上蒸馏法蒸馏3 h除去芳香油，残渣于60 ℃烘干，粉碎，取60～80目油樟叶粉末，用石油醚（沸程30～60 ℃）索氏抽提1 h脱脂，残渣 60 ℃ 烘干，称取脱脂油樟叶粉10 g，加入体积分数为70%的乙醇300 mL，80 ℃水浴回流提取4 h，过滤浓缩至浸膏，加100 mL水溶解，用100 mL石油醚萃取，取水层定容至500 mL即得油樟叶总黄酮样品测定液，将测定液用体积分数为85%的乙醇醇沉（以沉淀形式除去多糖、蛋白、鞣质等），过滤，滤液减压浓缩至膏稠状，真空冷冻干燥得油樟叶总黄酮粗品。

1 2 2 标准曲线的建立

1 2 2 1 芸香苷标准溶液的制备 精确称取120 ℃干燥至恒质量的芸香苷标准品10 0 mg，置于50 mL容量瓶中，加体积分数为70%的乙醇溶液溶解，用70%乙醇定容至刻度，摇匀即得0 2 mg/mL芸香苷标准溶液，4 ℃冰箱保存待用。

1 2 2 2 显色体系及测定方法 参考中国药典槐花中总黄酮测定方法 [10]，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色体系进行显色，分别精确吸取不同量的芸香苷标准溶液或样品溶液置于25 mL容量瓶中，均加水至6 0 mL，加5% NaNO2钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10% AI（NO3）3溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂空白为参比溶液，在不同波长下测定吸光度。

1 2 2 3 测定波长、参比波长的选择 分别吸取3 mL芸香苷标准液、3 mL样品测定溶液，按上述显色方法显色，以试剂空白为参比溶液，在400～700 nm范围内进行光谱扫描，选择标准品液和样品溶液显色络合物最大共同吸收波长为测定波长，选择最大吸收波长下端某一点波长为参比波长 [11]。

1 2 2 4 标准曲线的制作 精确吸取芸香苷标准溶液1 0、2 0、3 0、4 0、5 0、6 0 mL至25 mL容量瓶中，按上述显色方法显色后，分别在测定波长和参比波长下测定吸光度，求吸光度差ΔD（D测定波长-D参比波长），以ΔD为纵坐标，质量浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程。以在测定波长处的测定值为单波长分光光度法测定结果。

1 2 3 显色稳定性试验 吸取样品溶液2 mL至25 mL容量瓶中，按上述显色方法显色后，分别在室温下放置0、30、60、90、120、150 min后测定吸光度差值ΔD，计算RSD值。

1 2 4 精密度试验 分别精确吸取3 mL样品溶液至5个25 mL容量瓶中，按上述显色方法显色后，测定吸光度差值ΔD，计算RSD值。

1 2 5 重现性试验 精确称取脱脂油樟叶粉末5 g，共5份，按油樟叶总黄酮的提取方法、显色测定方法操作，分别测定吸光度差值ΔD，计算RSD值。

1 2 6 加标回收率试验 分别精确吸取3 mL已知浓度的样品溶液至3个25 mL容量瓶中，各加1 mL芸香苷标准溶液，按上述显色方法显色后，测定吸光度差值ΔD，根据标准曲线计算溶液浓度，求平均回收率、RSD值。

1 2 7 样品溶液的测定 精确吸取3 mL样品溶液至25 mL容量瓶中，按上述显色方法显色后，测定吸光度差值ΔD，根据标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量，重复测定5次。

1 2 8 抗油脂氧化试验 采用烘箱储藏试验法 [12]测定，称取30 g猪油或菜籽油置于50 mL碘量瓶中，按0 08%、016%、0 32%、0 64%质量百分比添加油樟叶总黄酮粗品，以0 02% 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、0 08%抗坏血酸（维生素C）为阳性对照，以纯猪油或菜籽油为空白对照，70 ℃ 加热搅拌30 min充分混匀，置于（70±1） ℃烘箱中，每隔12 h搅拌1次，并交换在烘箱中的位置，每24 h参照GB/T 5009 37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》规定的方法测定油样过氧化值（POV）。同时以BHT为协同增效剂，油樟叶黄酮和BHT分别按油样质量0 16%、0 02%加入油样进行协同抗氧化试验。参考GB 10146—2005《食用动物油脂卫生标准》、GB/T 5538—2005《动植物油脂 过氧化值测定》 对猪油、菜籽油POV的规定，设定猪油、菜籽油氧化诱导终点POV为0 2 g/100 g。将油脂的氧化过程归为一级反应，其反应方程如下：

[JZ]lnC=-kt+lnC0。

式中：C为油脂氧化后的过氧化值，C0为油脂初始过氧化值，k为速率常数，t为时间。根据该方程求出油脂氧化速率常数k，由回归方程计算出油脂POV达到0 2 g/100 g时的氧化诱导时间。

抗氧化保护系数（PF）是添加抗氧化剂的油脂氧化诱导时间与空白油脂的氧化诱导时间之比，表示抗氧化剂的抗油脂氧化作用强弱，PF越高，抗氧化作用越强。评价标准为PF=1，无抗氧化作用；2≥PF>1，有一定抗氧化作用；3≥PF>2，有明显抗氧化作用；PF>3，有显著抗氧化作用 [13-14]。

2 结果与分析

2 1 总黄酮含量的测定

由图1可知，芸香苷标准品最大吸收波长为510 nm，样品溶液的最大吸收波长发生了蓝移，为490 nm，二者存在一定差异，可能由于样品溶液中存在其他干扰成分导致吸收波长蓝移。根据双波长分光光度法波长选择原则 [15]，样品溶液在510 nm处也有较强吸收，选择510 nm为测定波长，选择其下端与芸香苷标准品吸收曲线交叉处的等吸收点585 nm为参比波长。采用双波长分光光度法、单波长分光光度法测定芸香苷标准曲线回归方程的r2分别为0 999 2、0 999 3，二者相近，可见在0 008 0～0 048 0 mg/mL浓度范围内，2种方法测定芸香苷的线性均良好（图2）。双波长法和单波长法的显色稳定性在0～150 min内吸光度变化较大，样品溶液吸光度RSD分别为7 48%、7 98%；0～60 min内，样品溶液吸光度RSD分别为4 51%、4 91%，表明在显色0～60 min内测定油樟叶总黄酮，2种方法的稳定性均较好，但双波长法优于单波长法。精密度、重现性、加标回收率试验表明，双波长法RSD均小于单波长法，但2种方法RSD均小于5%，加标平均回收率分别为92 23%、90 11%。可见，测定油樟叶总黄酮2种方法显色60 min内稳定性、精密度、重现性、回收率均较好，双波长法比单波长法更准确可靠。双波长分光光度法测得脱脂油樟叶总黄酮提取液中总黄酮含量为19 21 mg/g，低于单波长法测得的含量（20 18 mg/g）（表1）。10 g脱脂油樟叶采用醇提法获得总黄酮粗品382 mg，双波长法测得其纯度为3587 mg/g。孙崇鲁等采用正交试验研究了与油樟同属植物香樟[Cinnamomum camphora （Linn ） Presl]叶中总黄酮的提取工艺，其黄酮提取含量达39 68 mg/g [16]，高于本试验制备的油樟叶中总黄酮含量，可见油樟叶总黄酮的提取工艺值得进一步研究。

2 2 抗油脂氧化试验

由图3、图4可知，猪油、菜籽油经高温加速诱导后，随着氧化时间的增加，各组POV值逐渐升高。猪油、菜籽油中添加不同浓度油樟叶总黄酮粗品后，相同时间内加抗氧化剂油样的POV值均低于纯油空白组。同一时间下，随着油樟叶总黄酮粗品添加量的增加，油样POV值逐渐降低。由表2可知，添加抗氧化剂后，油样氧化诱导时间、PF值均大于空白纯油对照，测试浓度范围内抗氧化剂的PF值均大于1小于2，可见油樟叶总黄酮粗品对猪油、菜籽油均具有一定抗氧化活性，且有明显剂量效应关系。0 08%油樟总黄酮对猪油、菜籽油的PF值与0 08%维生素C均相近，但较小，表明当油樟叶总黄酮粗品添加量达到0 08%时，其对猪油和菜籽油的抗氧化活性与维生素C相当，但活性较弱。0 32%油樟总黄酮对猪油的PF值与0 02%BHT相近，0 16%油樟总黄酮对菜籽油的PF值与0 02%BHT相近，表明油樟总黄酮对油脂的抗氧化活性与0 02%BHT相当，在猪油中添加量需达到032%，在菜籽油中添加量需达到0 16%。当油樟叶总黄酮添加量高于0 32%时，其对猪油、菜籽油的抗氧化活性强于0 02%BHT。油樟总黄酮低浓度添加量对猪油的PF值小于菜籽油，高浓度添加量（0 64%）则相反，表明油樟总黄酮中低浓度添加量对菜籽油的抗氧化效果好于猪油，高浓度添加量对猪油的抗氧化作用优于菜籽油。

3 结论与讨论

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色体系测定样品中总黄酮含量较为常见，对于组分较复杂的样品溶液，采用单波长测定方法容易引起干扰，双波长测定法可消除共存组分的干扰，获得更高的可靠性 [15，17]。本试验结果表明，双波长分光光度法、单波长分光度法的稳定性、精密度、重现性、回收率均较好，2种方法均可用于油樟叶总黄酮含量的测定。但单波长测定法的稳定性、精密度、重现性、回收率RSD值均高于双波长测定法，测得样品中总黄酮含量高于双波长法，这可能是由于油樟总黄酮提取液中含有较多其他干扰组分，影响了显色反应体系，造成单波长法的可靠性偏低，测定结果偏高 [18]。测定液显色后，与芸香苷标准溶液相比，油樟总黄酮提取液的吸收光谱发生一定程度蓝移，这一现象也表明油樟叶提取液中可能含有较多干扰吸收的组分。因此，对于油樟叶提取液的总黄酮含量测定，采用双波长法比单波长法能更好地消除复杂组分等背景干扰。双波长分光光度法测得脱脂油樟叶总黄酮含量为19 21 mg/g，其结果准确可靠，可作为油樟叶总黄酮含量测定方法。黄酮类化合物可通过消除铁、铜等金属离子的催化作用来提高氧化反应的活化能，从而阻碍氧化反应；也可将氢供给脂肪自由基（R·）和过氧化自由基（ROO·）后转变为酚基自由基（A·），分别生成脂肪分子（RH）、氢过氧化物（ROOH），酚基自由基能降低自动氧化连锁反应速度，从而抑制油脂进一步氧化 [18]。本试验结果表明，油樟叶总黄酮对猪油、菜籽油均有一定抗氧化作用，具有一定量效关系。0 08%维生素C对猪油、菜籽油的抗氧化活性均较弱，可能是由于维生素C属水溶性抗氧化剂，在油脂中溶解度低，有效浓度低导致抗油脂氧化活性弱。0 32%油樟总黄酮与0 02%BHT对猪油抗氧化作用相当，0 16%油樟总黄酮与0 02%BHT对菜籽油抗氧化作用相当；当油樟叶总黄酮添加量高于0 32%时，其对猪油、菜籽油的抗氧化活性均强于0 02%BHT。油樟总黄酮与BHT联合使用具有协同抗猪油、抗菜籽油氧化作用。

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