橄榄果实总RNA提取方法的比较

李安玉, 佘文琴

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

橄榄果实总RNA提取方法的比较

李安玉, 佘文琴

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

针对橄榄果实富含酚类、多糖、蛋白质等次生代谢物的特点，采用百泰克总RNA抽提试剂盒法、Trizol法和CTAB法提取橄榄果实总RNA，用紫外分光光度计测定其纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检验其完整性。结果表明，CTAB法提取的RNA纯度高，完整性较好，受多糖多酚影响较少，且无DNA和蛋白质污染，适宜用于后续研究。

橄榄果实; 总RNA; CTAB法；Trizol法；琼脂糖凝胶电泳

橄榄(CanariumalbumL.)属橄榄科(Burseraceae)橄榄属(Canarium)，是我国南方的特色果种，主要有滇榄、方榄、白榄、乌榄、小叶榄、越榄，产地包括广东、海南、福建、台湾及云南等，多见于常绿阔叶林及其次生林中，栽培种主要有白榄和乌榄[1]。橄榄鲜果不仅富含碳水化合物、Ca、Vc等营养成分[2]，还具有开胃下气，解酒护肝等药用价值[3]，其药食两用的保健功能，深受广大消费者喜爱。

提取高质量的RNA是进行Northern-Blot分析、RT-PCR以及构建cDNA文库等分子生物学研究的基础。由于酚类和蛋白质等次生代谢物质以及核糖核酸酶的广泛存在，往往很难获得纯度高、完整性好的橄榄果实RNA，即使微量核糖核酸酶都会使提取的RNA降解；多糖是影响RNA提取的另一个重要因素，多糖在水中的理化性质与RNA相似，在提取过程中往往会与RNA形成难溶的胶状物共同沉淀下来[4]，传统的提取方法难以将它们分离，而且在除去多糖的同时，RNA也会被部分除去，造成RNA产量的降低[5-6]。本研究采用百泰克总RNA抽提试剂盒法、Trizol法和CTAB法等3种方法提取橄榄果实总RNA，并对提取结果进行比较分析，探索最佳的提取方法，以期为相似物种RNA的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的橄榄果实采自福州绿百合现代农业有限公司种植基地。采回的橄榄鲜果用清水冲洗后擦干，切碎果肉，液氮速冻，分装，冷藏于-80 ℃冰箱，备用。

试验试剂包括百泰克多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(RP3301)、Trizol试剂、十六烷三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)等；氯仿、异戊醇、无水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、LiCl、β-巯基乙醇等，均为国产分析纯。

试验仪器包括凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)、台式低温冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)、恒温水浴锅、电泳仪(北京六一仪器厂)、TU-1810紫外可见分光光度计、移液器(德国Eppendorf公司)等。试验所需塑料制品均用0.1%DEPC水37 ℃处理12 h以上，高温高压灭菌，65 ℃烘干。

1.2 试验方法

1.2.1 百泰克试剂盒法 依照北京百泰克公司多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒(RP3301)说明书步骤进行，以 30 μL 无RNA酶水溶解沉淀，取3 μL检测，其余-80 ℃保存备用。

1.2.2 Trizol法 取0.1 g橄榄果肉直接放入研钵中，加入少量液氮迅速研磨，转入离心管中并加入1 mL Trizol试剂，用匀浆仪进行匀浆处理，将匀浆样品在室温下放置5 min，使核酸蛋白复合物完全解离，4 ℃，10 000 r·min-1离心10 min，取上清。上清液中加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min，离心15 min，把上层水相转移到新管中，加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min，离心10 min，移去上清，加入1mL 75%乙醇洗涤2次，4 ℃，7 500 r·min-1离心5 min，弃上清，室温放置15 min，晾干，加入30 μL 无RNA酶水，用枪头吸打几次，溶解沉淀，取3 μL检测，其余-80 ℃保存备用。

1.2.3 CTAB法 CTAB提取液的配制：0.02 g·mL-1CTAB，0.02 g·mL-1PVP，100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol·L-1EDTA，2.0 mol·L-1NaCl，0.02 g·mL-1β-巯基乙醇(使用前加入)。在1.5 mL离心管中加入1 mL CTAB提取液和20 μL β-巯基乙醇，于65 ℃预热。称取0.1 g橄榄果实于液氮中迅速研磨成粉末，将样品移至预热好的装有CTBA提取缓冲液离心管中，涡旋混匀30 s，65 ℃温浴20 min，期间保持振荡1-2次，然后每管加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡旋混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min。取上清移至新离心管，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，再次离心。取上清移至新离心管，加入等体积8 mol·L-1LiCl，-20 ℃下沉淀2 h后离心10 min，弃上清，加入500 μL无水乙醇，再离心10 min，弃上清，加入500 μL 75%乙醇清洗管底沉淀，倒掉75%乙醇，吸干离心管中残留的液体，RNA沉淀在超净台上干燥15 min，用30 μL无RNA酶水溶解沉淀，取3 μL检测，其余-80 ℃保存备用。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳检测

凝胶电泳是检测RNA质量的一种重要手段，从电泳胶上不仅可以判断RNA的完整性和降解程度，也可以判断有无DNA、蛋白质和多糖污染。本试验所得RNA的凝胶电泳结果见图1。由图1可知，百泰克试剂盒法可以看到清晰的28S、18S和5S 3条条带，虽然28S与18S亮度比值接近2∶1，条带之间有弥散现象，但是出现5S条带说明RNA有所降解，所提取的RNA完整性不是很好。CTAB法可以看到28S和18S完整的2条条带，且28S与18S亮度比值接近2∶1，条带之间无弥散现象，加样孔内干净，表明没有蛋白质和多糖等其他物质污染，因此，采用此法提取的RNA完整性较好。Trizol法可看到2条微弱的28S、18S条带，条带之间有弥散现象，表明RNA严重降解，点样口也能见到微弱的荧光，表明有多糖和蛋白质等杂质的污染，提取效果较差。综上所述，CTAB法提取的RNA条带清晰，结构完整，此方法最适宜用于橄榄果实总RNA的提取。

A.百泰克试剂盒法;B.CTAB法;C.Trizol法。

2.2 紫外分光光度计检测

纯净RNA样品的D260 nm/D280 nm介于1.7-2.0之间，D260 nm/D230 nm在2.0-2.2之间[7-10]。将3种方法所提取RNA的纯度和浓度经紫外分光光度计检测，结果见表1。由表1可以看出，CTAB法提取的RNAD260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm均在此范围内，说明样品中RNA不含多糖等杂质，且RNA浓度最高，表明RNA纯度好；百泰克试剂盒法的比值稍微偏离此范围，其RNA浓度也较CTAB法低，提取效果一般；Trizol法的比值不在此范围内，说明样品中存在蛋白质或酚类等其他有机物的污染，且浓度最低，不适合用于后续试验。综上所述，利用CTAB法提取的橄榄果实总RNA纯度高，完整性好，最适合用于后续研究。

表1 3种方法提取橄榄果实总RNA的纯度和浓度

3 结论与讨论

在进行以RNA为基础的分子生物学试验中，应根据植物材料的不同，选择适合的RNA提取方法[11]。由于核糖核酸酶的广泛存在，加之橄榄组织中富含酚类、多糖和蛋白质等次生代谢物质，给橄榄果实RNA提取带来了一定的困难[12]。本研究表明，CTAB法提取的RNA纯度高，完整性较好。百泰克试剂盒法与Trizol法提取的RNA或有多糖、多酚和蛋白质等次生代谢物质的污染，或者严重降解。因此，能否有效去除这些杂质，且避免核糖核酸酶的降解是提取橄榄果实RNA的关键。

本试验中CTAB法同时使用了PVP和β-巯基乙醇，可有效防止多酚物质与RNA的结合，抑制多酚的氧化和核糖核酸酶活性，提高RNA产量[13]；提取缓冲液中提高了NaCl的浓度，能够有效去除多糖杂质[14]；利用LiCl选择性沉淀RNA，去除了DNA的污染[15]；再经过无水乙醇和75%乙醇的洗涤，极大地除去了多糖、多酚等次生代谢物质，得到纯度较高的RNA，满足后续试验的要求。

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(责任编辑:张云燕)

Comparison of total RNA extraction methods of olive fruits

LI An-yu, SHE Wen-qin

(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Features of olive fruits are rich in polyphenols, polysaccharides, proteins and other secondary metabolites, BioTeke total RNA extraction kit, Trizol and CTAB methods were used for total RNA extraction of olive fruits, the ultraviolet spectrophotometer was used to measure the purity, and the agarose gel electrophoresis was used to test the integrity. The results showed that, the RNA extracted by CTAB method performed high purity and better integrity which less affected by the polysaccharide polyphenols, as well as no contamination of DNA and proteins, thus could be used for future research.

olive fruits; total RNA; CTAB method; Trizol; agarose gel electrophoresis

2015-06-30

福建省科技重大专项(2013NZ0002-1C)。

李安玉(1991-)，男，硕士研究生。研究方向：果树生物技术。Email：15880491259@163.com。通讯作者佘文琴(1970-)，女，教授，博士。研究方向：园艺植物生理生化与分子生物学。Email：Wenqinshe@163.com。

S667.5；Q522

A

1673-0925(2015)03-0198-04

10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2015.03.012