核桃基腐病拮抗细菌的筛选与初步鉴定

刘晓琳+肖俊文+王晓炜+马荣+赵祥+阿地力·沙塔尔

摘 要：核桃基腐病已成为影响核桃生产的重要病害之一，为了得到对核桃基腐病有拮抗作用的拮抗菌株，采用组织分离法，在分离核桃基腐病过程中得到细菌，利用平板对峙法，最终筛选得到1株拮抗效果较强的菌株GY-11，对核桃基腐病的拮抗效果达到80%。结合形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定该拮抗细菌菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

关键词：核桃基腐病；拮抗细菌；筛选；鉴定

中图分类号：S436.64 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.07.021

Abstract： Walnut stalk rot （Pythium oligandrum） has become one of the important diseases that affect walnut industry in Xinjiang. Antagonistic bacteria strains GY-11 was got from flat confrontation culture， while its bacteriostatic rate was 80% to Pythium oligandrum. The bacterial colony and thalli shape， physiological and biochemistry experiments and determination of the sequence of 16S rDNA of the bacteria had been done. The strain GY-11 was identified as Bacillus subtilis.

Key words： walnut stalk rot； antagonistic bacteria； isolation； identification

核桃（Juglans regia L.） 属落叶乔木，是我国重要的经济树种，具有丰富的营养价值和保健功能，可制取食用油和制作各种食品[1]。核桃作为新疆的第二大果树，其种植面积占全疆林果总面积的四分之一[2]，是农村经济发展的重要支柱之一。核桃适生范围广，常被栽植于山区和田园，是重要的用材树种和生态树种[3]。近几年，新疆核桃种植面积逐渐扩大，由于大面积种植单一品种、管理粗放以及栽培模式等原因，病虫害问题日益增多，尤其是核桃基腐病（Pythium oligandrum Drechsler），严重制约了核桃的健康发展。

目前，防治核桃基腐病的方法主要以化学方法为主，通过大田试验筛选出了咪酰胺等防效较好的药剂[4]。常规的化学药剂在防治核桃基腐病方面，有经济、高效和方便等优势，但其易被环境污染，不利于打造生态健康果园。最近几年通过生防菌株防治果树病害已成为一种重要的防治手段，目前应用较多的拮抗细菌主要有芽孢杆菌 Bacillus subtilis、假单胞杆菌Pseudomonas spp.、土壤放射杆菌 Agrobacterium radiobacter 等[5]。然而通过拮抗菌株防治核桃基腐病的研究尚未见报道。因此，筛选出抗菌谱广、生防活性高及对环境安全的新型拮抗细菌，制备成高效的生防菌剂，对该病害的防治具有重要意义。本研究从分离核桃基腐病病原菌过程中获得细菌，并通过平板对峙培养法筛选出抑制效果的生防细菌，并对其进行种类鉴定，以期为生防菌株的进一步开发利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株：核桃基腐病病原菌由新疆农业大学林学与园艺学院病理实验室提供。

培养基：核桃基腐病病原菌的培养和拮抗菌株的分离采用PDA培养基；拮抗菌的纯化采用NA培养基；拮抗菌的液体培养采用LB 培养基；生理生化特性的测定需要采用耐盐性试验培养基、淀粉水解试验培养基、V.P试验培养基、吲哚产生试验培养基、甲基红试验培养基、卵磷脂酶试验培养基、菌膜形成试验培养基、接触酶试验培养基、需氧性测定试验培养基。

1.2 拮抗菌株的分离

拮抗菌株的分离采用常规组织分离法。核桃基腐病病害标本采集于新疆和田地区墨玉县，在材料的病健交界部位切成5 mm的组织块，用 75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸钠消毒90 s，无菌水冲洗3次，最后将组织块放置于 PDA 培养基上，28 ℃恒温培养，将长出的细菌菌落在NA平板上划线法纯化后，将单菌落于4 ℃保存。

1.3 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙培养法。将上述分离到的细菌活化培养后，等距离（距离病原菌2 cm左右）划线至已接种核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌为对照，每个处理3个重复。28 ℃恒温培养，待对照菌丝即将长满时，测量细菌菌株与病原菌之间的抑菌带宽度[6]，计算抑制率：

抑制率=（对照平板菌落直径-处理平板菌落直径）/对照平板菌落直径×100%

1.4 拮抗菌株在不同时间段的生长情况

挑取单菌落接种于含有50 mL NB培养基的250 mL的三角瓶中，震荡培养24 h （28 ℃、180 r·min-1），制成种子液。取盛有50 mL NB培养液的250 mL三角瓶25个，分别编号为0，2，4，6，8， 10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48 h。

取2 mL种子液，接种于50 mL NB 培养基中，180 r·min-1，28 ℃振荡培养。以灭菌NB培养基为对照，分别从对应时间的三角瓶取出培养液，测定OD600值。根据测定数值绘制生长曲线[6-7]。

1.5 拮抗菌株的鉴定

1.5.1 菌株形态学和生理生化特性测定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《芽孢杆菌属》[9]中介绍的方法，观察菌株及菌落形态，测定拮抗细菌的需氧特征、NaCl耐受度、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、接触酶、V-P试验、甲基红试验、明胶液化等生理生化指标。

用接种针分别挑取24 h培养的菌株，分别接种于PDA、PSA的液体培养基和NB、LB培养基，封口，180 r·min-1，28 ℃下振荡培养24 h，测定OD600值，观察菌株的最适培养基。

1.5.2 菌株的分子生物学鉴定 通过试剂盒提取菌株的DNA，采用引物对63f （5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）和1387r （5'- ACGGCTACCTTGTTACGACT -3'），进行PCR反应。PCR反应体系为50 μL： 模板DNA 2.5 μL，引物各2.5 μL，dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，ddH2O补足50 μL。PCR扩增条件： 94 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶成像检测，PCR产物由北京天根生物有限公司进行测序，序列经 ClustalX 1.83比对、校正和编辑后，用MEGA5.0软件中的NJ法（Neighbor-Joining，邻接法）构建系统发育树，应用自展法（bootstrap）检验系统树，自展数据集为1 000次。以Amphibacillus xylanus作为外群[10]。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

将分离得到的菌株，通过与核桃基腐病病原菌平板对峙培养，筛选得到3株拮抗效果较好的细菌菌株，其中仅有菌株GY-11具有较强的拮抗的效果，抑制率达到80%。因此，选用菌株GY-11做进一步研究。

2.2 拮抗菌株在不同时间段的生长情况

菌株GY-11在 NB 培养液中的生长情况（图1），菌株在0～4 h 生长较慢，4～10 h 生长最快，菌株量呈典型的对数；在10～30 h的时间段菌体的生长量变化不大，达到稳定期；在30～48 h菌株的生长量有明显的下降趋势，此后进入衰亡期。

2.3 拮抗菌株的初步鉴定

2.3.1 菌株的形态学和生理生化特征 菌株在不同培养基上生长存在一定差异，在NA培养基上生长最好，其次是PDA。菌株GY-11在NA培养基上培养2 d后观察，其单菌落为圆形，乳白色，白色边缘不圆滑似圆形，表层不规则突起，褶皱明显。显微观察，菌体为杆状，革兰氏染色呈现紫色，鞭毛特征不明显，为革兰氏阳性菌。

生理生化特性表明：菌株为革兰氏阳性菌，厌氧菌，有氧条件下生长微弱；最适的生长温度为27 ℃；在含有5%或7%NaCl的液体培养基上生长良好，盐度越高，生长越缓慢，说明菌株耐盐性一般；不能利用柠檬酸盐做碳源；菌株过氧化氢试验为阳性反应；可使明胶液化；有菌膜形成；甲基红试验呈阳性反应；V-P试验为红色，为阳性反应（表1）。形态学与生理生化特征的鉴定结果表明，菌株GY-11与芽胞杆菌属的描述一致。

2.3.2 分子生物学鉴定 将测序结果在GenBank数据库中进行同源性比对，Blast结果表明，菌株与枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis的16S rDNA序列同源性为99%，在GenBank注册的序列号为KP876486。从基于邻接法构建的16S rDNA 系统发育树（图2）可以发现：菌株GY-11与模式菌株枯草芽孢杆菌（KF496886）聚类在同一大分支内（支持率99%），并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株GY-11为枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis。

3 结论与讨论

本研究通过常规组织分离病原菌得到细菌菌株，利用平板对峙法，筛选出拮抗菌株GY-11，其拮抗效果达到80%。利用形态学、生理生化特性和分子生物学技术鉴定该拮抗菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

拮抗细菌防治植物病害是当今植病界十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景[11]。目前用芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究已成为国内外研究的热点，有关芽孢杆菌在植物生物防治上的应用报道很多，其具有生长快、营养简单、抗性强、易存活与繁殖以及对人畜无害、不污染环境、制剂稳定和施用方便等优点，符合绿色食品的要求，且为农业的可持续发展提供了保障[12]。枯草芽孢杆菌对多种植物的多种病害都具有防治作用[13-15]，但是对核桃基腐病的防治研究未见有报道。本研究通过试验筛选得到一株对核桃基腐病病原菌有较好抑制效果的枯草芽孢杆菌菌株GY-11。本研究仅对拮抗菌株的分类地位和培养时间开展了研究，后期拟进一步开展关于拮抗菌株的最适碳氮源、最适发酵条件的研究，以期为该菌株进一步的开发应用奠定理论基础。

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