复方当归注射液对缺血性脑损伤大鼠BDNF表达的影响

汤轶波，袁伟畅，朱春燕，张　赛，张　玮，张林朋，南一楠，牟天龙，王　旭，杨晓敏，何雪飞，潘彦舒

(北京中医药大学基础医学院病理学系，北京100029)

复方当归注射液对缺血性脑损伤大鼠BDNF表达的影响

汤轶波，袁伟畅，朱春燕，张赛，张玮，张林朋，南一楠，牟天龙，王旭，杨晓敏，何雪飞，潘彦舒

(北京中医药大学基础医学院病理学系，北京100029)

目的：观察复方当归注射液(CAI)对局灶性脑缺血损伤模型大鼠患侧脑组织及血清中脑源性神经营养因子(BDNF)表达水平的影响，探讨CAI对脑缺血损伤的作用机制。方法：50只SD大鼠随机分为假手术组(10只)和局灶性脑缺血损伤组(40只)。局灶性脑缺血损伤组采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血损伤模型，将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、CAI组和阳性对照依达拉奉组，每组10只。造模大鼠苏醒后进行神经功能评分，7 d后取材，HE染色检测大鼠脑组织的病理学改变，测定大鼠血清及缺血侧脑组织中BDNF的表达水平。结果：与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分增加(P<0.05)，大鼠神经细胞出现肿胀、坏死和细胞间质水肿等改变，缺血侧脑组织及血清中BDNF表达水平有一定的上升趋势；CAI组大鼠缺血侧脑组织BDNF表达水平显著升高(P<0.05)，血清BDNF表达水平有所升高。与模型组比较，CAI组大鼠神经功能评分降低，大鼠神经细胞轻微水肿，缺血侧脑组织及血清BDNF表达水平有所升高。结论：CAI可能具有提高脑内BDNF表达的作用，其作用机制可能与机体在缺血损伤情况下脑内相应的神经因子做出应激反应有关。

复方当归注射液；局灶性脑缺血；脑源性神经营养因子；疾病模型，动物

复方当归注射液(Compound Angelica Injection,CAI)是一种中药方剂，主要由当归、川穹和红花等中药精制而成[1]。具有活血通经和祛瘀止痛的功效。近年来，该药剂被广泛应用于哮喘、疼痛、高脂血症以及部分妇科疾病等的临床治疗，收效显著[2-4]。已有研究[5]证实：复方当归注射液改善缺血缺氧性损伤具有显著作用，但有关其在缺血性脑损伤中作用的研究尚少。本课题组前期研究[6]发现：CAI能显著改善缺血性脑损伤大鼠的神经行为学功能，并减小大鼠的脑梗死体积。本研究探讨复方当归注射液对大鼠局灶性脑缺血损伤后患侧脑组织匀浆及血清脑源性神经营养因子(brain dervied neurotrophic factor,BDNF)表达的影响，阐明CAI发挥神经保护作用的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物、药物、主要试剂和仪器健康清洁级雄性SD大鼠50只，体质量250～270 g，购于北京维通利华实验动物公司，动物许可证编号：SCXK(京)2012-0001。CAI购自福建古田药业有限公司，批号1304062；依达拉奉注射液购自南京先声东元制药有限公司，批号80-130404；水合氯醛购自美国Sigma公司；BCA检测试剂购自碧云天生物技术有限公司；BDNF ELISA KIT(CYT306)购自美国Millipore公司。SXP-1B型手术显微镜(上海医用光学仪器厂)，1411型高频小电刀(上海医疗器械技术公司)。

1.2动物分组和给药50只SD大鼠适应性饲养3 d，室温22～25℃， 湿度40%～60%。将大鼠随机分为假手术组(10只)和局灶性脑缺血损伤组(40只)。局灶性脑缺血损伤组大鼠采用线栓法复制大鼠局灶性大脑中动脉缺血(MCAO)模型，将模型复制成功的30只大鼠随机分为模型组、CAI组和阳性对照依达拉奉组，每组10只。造模1 h后，CAI组给予1 mL·100 g-1CAI腹腔注射，每日2次(合生药0.2 g·100 g-1·d-1)，给药剂量参考文献[7]；阳性药物组给予0.3 mL·100 g-1依达拉奉注射液腹腔注射，假手术组和模型组给予注射用生理盐水0.3 mL·100 g-1腹腔注射，均每天给药1次。

1.3大鼠局灶性脑缺血损伤动物模型的建立根据Longa等[8]报道的线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型：以10%水合氯醛溶液(0.4 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠仰位固定，颈部正中切口，暴露左侧颈动脉三角，逐层分离组织，依次分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。分离ECA的分支甲状腺动脉，并电刀凝闭；分离颈外与颈内动脉之间的枕动脉，电刀凝闭。结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉(PPA)，用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA和PPA，用虹膜剪在ECA残端剪一楔形小口，由此插入钓鱼线(直径约0.25 mm，头端加热呈直径约0.3 mm的圆球形)，轻推钓鱼线使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，至大脑中动脉的起点，阻断大脑中动脉的血液供应，缝合颈部切口。假手术组手术过程与模型组相同，分离出左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，但仅结扎颈外动脉。

1.4大鼠神经功能评分造模大鼠苏醒后进行神经功能评分。评分标准参照Longa的5级评分方法评定动物的神经系统功能[8]。无神经功能障碍记为0分，轻度神经功能缺陷(左前肢伸展运动障碍等)记为1分，中度神经功能缺陷(向左侧转圈)记为2分，严重神经功能缺陷(向左侧倾倒)记为3分，不能行走及意识水平降低记为4分。评分为1～3分者视为造模成功，纳入实验。造模7 d后再次对各组大鼠进行神经功能评分。

1.5大鼠血清和缺血侧脑组织匀浆中BDNF表达水平检测实验结束后，每组动物麻醉、腹主动脉取血后断头处死，迅速取出全脑，分离出左侧(患侧)半球，制成10% 脑组织匀浆，以BCA法测定各蛋白样本浓度后待测。全血静置离心、分离血清后待测。用ELISA试剂盒测定血清及脑组织匀浆中BDNF表达水平。

1.6大鼠脑组织病理学检查实验结束后，每组动物麻醉，以肝素经主动脉弓灌注冲洗，滴注含10%甲醛的磷酸缓冲液灌注固定。取大鼠患者脑组织，用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，而后使用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，HE染色，显微镜下观察脑组织的病理学变化。

2　结　果

2.1大鼠神经功能评分假手术组大鼠神经功能未见异常(0分)。与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.05)，大鼠出现神经功能障碍；与模型组比较，CAI和阳性对照组大鼠神经功能评分均出现不同程度的下降(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠血清中BDNF表达水平与假手术组比较，CAI 组和阳性对照组大鼠血清 BDNF表达水平升高，但差异均无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，CAI 组血清 BDNF表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠患侧脑组织匀浆中BDNF表达水平与假手术组比较，模型组大鼠脑组织 BDNF表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；CAI组脑组织匀浆中BDNF表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组脑组织匀浆中BDNF 表达水平也有不同程度的升高(P>0.05)。与模型组比较，CAI 组脑组织 BDNF表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠神经功能评分及血清和脑组织中BDNF水平

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with model group.

2.4大鼠脑组织病理学改变假手术组大鼠脑组织神经细胞排列有序，形态正常，组织结构清晰完整，细胞膜清晰完整，核仁清晰可见，无水肿及炎性细胞浸润。模型组大鼠脑组织细胞排列紊乱，可见大量细胞变性、坏死，胞浆空化，核仁消失，细胞水肿。CAI及阳性对照组大鼠脑组织病理改变减轻，细胞排列较紊乱，胞核模糊或不可见，可见细胞变性、坏死，细胞水肿情况有所减轻。见图1(插页一)。

3　讨　论

在缺血缺氧诱导的脑损伤中，神经营养因子能发挥明确的神经保护作用，如BDNF和胰岛素样生长因子1(insuline like growth factor-1, IGF-1)等在脑内广泛存在的因子，对各种原因造成的脑损伤均有积极的神经保护作用[9-12]。

随着人们对中医药研究的逐步深入，中医药在治疗缺血性脑损伤方面的研究取得了巨大的进展，如黄芪总苷(AST)和葛根素等在内的中药成分，在缺血性脑损伤中能发挥显著的保护作用，并且这种保护作用与其提高脑内的神经营养因子，特别是BDNF的表达存在相关性[13-17]。本课题组前期研究[6]发现：CAI能显著改善缺血性脑损伤大鼠的神经行为学功能，减小大鼠的脑梗死体积。本实验作为前期研究工作的深入，进一步探讨复方当归注射液对患侧脑组织及血清中BDNF的表达是否有一定的干预作用。

本研究分析大鼠患侧脑组织匀浆中BDNF表达水平发现：相对于假手术组，模型组、CAI组和阳性对照组的BDNF表达水平均有升高的趋势，而CAI组BDNF表达水平升高有统计学意义。这个结果提示在缺血损伤发生后，机体可能会做出应激反应，脑内相应的神经因子的表达出现上调。大鼠血清中BDNF表达水平变化结果显示：假手术组动物血清中BDNF水平最低，其他3组BDNF水平均有一定升高趋势，而以CAI组的绝对值最高。

综合血清和患侧脑组织匀浆中BDNF的变化规律，本文作者发现：实现MCAO造模后的3个组别大鼠的BDNF水平均出现了升高趋势，尤以CAI组的数据绝对值为最高，这个结果提示CAI可能具有增加BDNF表达的作用。但在进行统计学分析处理时，几个组间多未出现统计学差异，仅假手术组和CAI组大鼠患侧脑组织匀浆中的数据比较差异有统计学意义。出现这种情况的原因可能是：①样本量。本实验中指标检测方法为ELISA，样本量为每组6～9只实验动物，样本量相对偏小；检测数据整体离散度大，数据标准差大，对统计学分析有一定的影响。②BDNF在脑内的表达部位。文献[18-19]报道：BDNF的表达部位较集中在梗死区边缘的皮质区、海马区及半暗带表达较密集。如果以免疫组织化学的方法在阳性颗粒表达密集的部位进行组间比较，更容易找出组间的差异性。但以ELISA法将整个患侧半球进行匀浆后检测，这种差异性会被弱化，增大样本量可以提高结果的科学性。③检测时间点的选择。脑缺血后BDNF表达水平有一定的时相性，本实验选择缺血7 d，时间点单一，如果增加检测的时间点，得到缺血后BDNF表达变化的连续性的数据对阐明CAI的干预规律将更有意义。

综上所述，CAI对缺血性脑损伤大鼠的BDNF表达水平可能具有一定的作用，这个结果需要更大样本量的实验来验证。

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Effect of Compound Angelica Injection on expression of brain derived neurotrophic factor of rats with cerebral ischemia injury

TANG Yibo, YUAN Weichang, ZHU Chunyan, ZHANG Sai, ZHANG Wei, ZHANG Linpeng, NAN Yinan，MU Tianlong,WANG Xu，YANG Xiaomin,HE Xuefei, PAN Yanshu

(Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Compound Angelica Injection (CAI) on the expressions of brain derived neurotrophic factor (BDNF) in brain tissue and serum in the rats with cerebral ischemia injury, and to explore the related mechanism of effect of CAI on cerebral ischemia injury. Methods50 SD rats were randomly divided into sham operation group (n=10) and cerebral ischemia injury group (n=40), and the rats in cerebral ischemia injury group were reproduced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Thirty successfully modeling rats were randomly divided into model group, CAI group and edaravone group (n=10). The neurologic scores of the rats after waking up were measured. The pathomorphology of brain tissue of the rats was detected by HE staining 7 d later. The levels of BDNF in the brain tissue and serum of the rats were detected. Results Compared with sham operation group, the neurologic score of the rats in model group was increased (P<0.05); the neurocytes of rats were changed to swell, necrosis, and interstitial edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing; the level of BDNF in brain tissue of the rats in CAI group was increased significantly (P<0.05), and the serum BDNF level was a little higher. Compared with model group, the neurologic score of the rats in CAI group was decreased (P<0.05); the neurocytes of rats were mild edema; the levels of BDNF in brain tissue and serum showed a tendency of increasing. Conclusion CAI may has a positive function in increasing BDNF expression,and the mechanism may be related to the stress reaction of corresponding neural factors in brain tissue under ischemia injury condition.

Compound Angelica Injection;focal cerebral ischemia; brain derived neurotrophic factor;disease models,animal

1671-587Ⅹ(2015)06-1103-04

10.13481/j.1671-587x.20150601

2015-08-21

国家自然科学基金资助课题(81271897)；国家重点基础研究发展计划(973计划)资助课题(2012CB518602)；北京中医药大学自主项目资助课题(2013-JYBZZ-JS-120)

汤轶波(1980-)，女，江苏省张家港市人，讲师，医学博士，主要从事中医药治疗缺血性脑病方面的研究。

潘彦舒，教授，硕士研究生导师(Tel: 010-64286887，E-mail: panyanshu@263.net)

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