普陀海域鲹科的DNA条形码研究

许泽滩，王红萍，顾寒梅，陈永久

（浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山　316022）

研究简报

普陀海域鲹科的DNA条形码研究

许泽滩，王红萍，顾寒梅，陈永久

（浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山316022）

舟山普陀海域的渔业资源丰富，为鱼类多样性研究提供了独特的优势。鲹是经济价值很高的海洋鱼类，普遍分布于热带，亚热带和温带海域，常栖息于普陀沿海海域。本文采用线粒体COI DNA序列，对来自普陀海域18尾鲹的样本进行分子条形码和物种多样性分析。结果显示，共有12个单倍型，分别隶属于7属8种，其中3种在该海域首次纪录。此外，结合GenBank的序列数据，共获得12属18种鲹的COI DNA同源序列，并构建了NJ与Bayesian聚类树。通过聚类关系，各物种的进化关系及其分类地位可以直观地显示出来。DNA条形码弥补了传统分类学在鲹科鱼的命名及分类归属上的不足，从而增进人们对鲹科鱼在舟山普陀海域物种多样性的了解，为当地养殖业及海洋保护提供科学理论框架。

普陀海域；鲹；DNA条形码；物种多样性

东海是西太平洋北部一个陆缘海，由于常年受到江河入海径流与暖流等的共同影响，为鱼类生存提供优良的自然环境条件，成为了我国重要的天然渔场［1-2］。东海的海洋渔业资源丰富，产量高，捕捞总量达到全国近50%［3］。在东海区，舟山渔场曾是我国渔业资源最为丰富，生产力水平最高的渔场之一［4］。地处舟山群岛东南部的普陀海域拥有大小岛屿455个，海域面积6 269.4 km2［5］，独特的地理环境为鱼类多样性的研究提供了优越的条件。

鲹科Carangidae隶属硬骨鱼纲Osteichthyes、鲈形目Perciformes，广泛分布于全球热带，亚热带及温带沿海海域。曾经根据其侧线上是否有棱鳞以及臀鳍基底与第二背鳍基底的长度比较分为鲹亚科Caranginae、鲳鲹亚科Trachinotinae、鰤亚科Seriolinae这三个亚科［1］，而目前被普遍认可的是在已有的基础上增加鰆鲹亚科Chorineminae［6］。在舟山群岛近海，包括东南部普陀海域记载的鲹科鱼类有11属17种（表1），其中蓝圆鲹Decapterus maruadsi、日本竹荚鱼Trachurus japonicus等［7］为该海域的主要经济鱼类。

自从TAUTZ等［8］首次提出DNA分类学的观点后，由HEBER等在其基础上首次真正提出DNA条形码［9］。DNA条形码通过目的基因DNA序列的差异来鉴定物种的新方法。这种方法能很好的弥补传统分类学上没有统一分类标准的缺陷，为新种的鉴定、隐存种及潜在的遗传多样性的挖掘提供有力的新的技术保障。同时可以纠正传统分类学中存在的分类错误。譬如传统分类学中认为梅童鱼属中存在着黑鳃梅童鱼Collichthys niveatus和棘头梅童鱼Collichthys lucidus两个物种，但是通过COI序列分析得出它们的遗传距离仅为0.004，推断二者遗传变异尚未达到种的分化水平［10］。

DNA条形码在鲹科种类鉴定和多样性分析中的应用较为广泛，JAAFAR等［11］应用DNA条形码挖掘出潜在物种，进而丰富物种多样性；HAQ等［12］通过DNA条形码，对观赏类金鲳鱼进行种内鉴定。本项研究尝试通过比较鲹科鱼线粒体COI DNA序列的种内和种间差异，以期建立普陀海域鲹科鱼类的DNA条形码，以及阐述物种多样性情况，同时可以验证COI DNA序列在鲹科鱼分子条形码分类中的适用性。此外，还可确立鲹科鱼类的分类地位及其分子系统进化关系。

1　材料与方法

1.1样本采集与保存

于2011年7月至2013年8月之间，在舟山群岛东南部普陀各岛屿（六横岛、桃花岛、登步岛、朱家尖以及舟山本岛）的沿岸海域采集了18个鯵样本。取胸鳍保存于95%乙醇中，于-20℃冰箱中保存。根据采集地不同，样本分别标记为：舟山本岛沈家门（简称SJM）、朱家尖（简称ZJJ）、登步岛（简称DB）、桃花岛（简称TH）、六横岛（简称LH）。图1显示采样地点的地理信息。

图1　地图显示鲹科鱼样本的采集地点Fig.1　Map shows sampling locations for Carangidae in the Putuo sea

1.2DNA提取、扩增及测序

图2　基于鲹科鱼类的线粒体COⅠ基因单倍型序列获得的Bayesian系统树Fig.2　Bayesian phylogeny of Carangidae based on COI DNA sequences

1.3数据分析

采用BioEdit v.7.0.9.0［14］编辑所得样本的DNA片段序列，再用ClustalX 2.0［15］将编辑好的DNA序列进行比对，并辅以人工校对。通过BLAST工具，将所得DNA序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/blast.cgi）及BOLD［16］中进行相似性检索，得出物种名称。使用DnaSP 5.0［17］软件检测多态位点、突变位点及单倍型数等信息。使用MAGA 5.0［18］软件检测不同序列的碱基含量，以及计算种间及种内Kimura-2-parameter（K-2-P）遗传距离。聚类分析采用MAGA 5.0软件中的邻接法（neighbour-joining，NJ）和MrBayes v.3.1［19］软件中的贝叶斯法（Bayesian）。聚类树各分支上的置信度值为10 000次重复抽样检验；贝叶斯法采用两个同步搜索，每次由4个MCMC（Markov Chain Monte Carlo）链和1 000万重复的间隔为1 000的采样组成。最初的2 500个树丢弃，链间分裂频率的平均标准差用来推断MCMC运行的完善程度。最佳核苷酸替换模型由jModeltest v.0.1.1［20］计算得出。

2　结果

从普陀近海海域获取到的18尾鲹样本中，经过测序和BioEdit v.7.0.9.0编辑后，获得长度为615 bp 的CO1 DNA片段序列。在BOLD中查询的结果显示，这18尾鲹科鱼分别归属于8个物种，7个属共检测到11条单倍型（表1），单倍型多样性指数为0.915 0（Hd），核苷酸多样性指数为（Pi）0.126 89，变异位点为182，约占29.6%。COI序列中T、C、A、G的含量分别为30.4%、27.4%、24.6%、17.6%。A+T的含量（55.0%）明显高于C+G的含量（45.0%）。K-2-P计算的遗传距离显示，鲹科鱼种内的距离值为0.000～0.003，平均为0.000 8；其中，六带鲹的平均种内遗传距离为0.002 1，卵形鲳鲹的平均种内遗传距离为0.000 5，少耙若鲹的平均种内遗传距离为0.001 6。属内种间距离值为0～0.15，平均为0.042 5。科属间距离值为0.020～0.23，平均为0.164（表2）。从表2可以看出，属内种间距离明显大于种内距离（约51倍），科内属间的距离都大于属内种间的距离。

根据赵盛龙和钟俊生［7］的新考所列的这个海区鲹科鱼种类，另外18条鲹科鱼的序列从GenBank中下载，获得36条长度为602 bp的COI DNA序列。这36条DNA序列共定义了26个单倍型。BOLD建议DB2与Trachurus japonicus Temminck et Schlegel，1842（竹荚鱼）合并为1个单倍型；TH4和TH7与Caranx sexfasciatus Quoy&Gaimard，1825（六带鲹）共享1个单倍型；TH5、TH6、TH9、ZJJ1、ZJJ2与Trachinotus ovatus（Lacepede，1801）（卵形鲳鲹）共享1个单倍型；LH2与Alectis ciliaris（Bloch，1788）（短吻丝鲹）共享1个单倍型；SJM与Alepes kleinii（Bloch，1793）（丽叶鲹）共享1个单倍型；LH1、DB1与Carangoides hedlandensis Whitley，1934（少耙若鲹）共享1个单倍型；LH3与Decapterus akaadsi Abe，1958（红尾圆鲹）共享1个单倍型。

贝叶斯法系统关系分析采用jModeltest软件建议的最佳核苷酸替换模型HKY+G+I。以青石斑鱼Epinephelus awoara（Temminck&Schlegel，1842）（Genbank登录号为NC_018773）为外群，获得的鲹科NJ聚类树和Bayesian系统树的拓扑结构基本一致（贝叶斯树如图2）。两个树一致显示，红尾圆鲹与蓝圆鲹（遗传距离为0.022）聚成一支，为姐妹种；黑纹条鰤和黄尾鰤合成一支；丽叶鲹与及达副叶鲹合为一属。

3　讨论

本研究建立了采自舟山普陀海域的鲹科鱼类的线粒体COI DNA条形码。DNA序列分析表明，鲹科鱼属内种间距离明显大于种内距离。所建立的DNA条形码符合HEBERT等提出DNA条形码的要求：种内距离小于0.01，属内种间的遗传距离必须显著大于种内的遗传距离，而且种间距离与种内距离的比值必须达到10倍以上。另外，属内种间的遗传距离和科内属间的遗传距离存在重叠部分，这种现象先前张俊斌等［21］已有报道。JAAFAR等［11］为生活在印度马来群岛海域的36种鲹科鱼进行其线粒体的COI序列检测，结果发现，在鲹科鱼的不同分类阶层中，K-2-P距离存在一定的重叠：种内距离：0～0.048 2；属内种间距离：0～0.164 0；科内距离：0.086 4～0.253 9，与本次实验获得的数据较为相近（种内距离0～0.003；属内种间距离：0～0.15；科内距离：0.022～0.23）。HAQ等［12］对金鲳鱼Trachinotus blochi Lacepede，1801的鉴定过程中发现，其长度为637-655 bp的DNA序列中，T的含量表现为最高（约30%），而G的含量则为最低（约18%），其（A+T）的含量始终高于（G+C）的含量。本实验中的18尾鲹科鱼的长度为627 bp的CO1序列中同样得到相似的结论：T、C、A、G的含量分别为30.4%、27.4%、24.6%、17.6%。A+T的含量（55.0%）明显高于C+G的含量（45.0%）。

DNA条形码结果建议，普陀海域的18尾鲹分别归属于7属8种。从获得的聚类树上可以看出，这些鲹形成3个分支，可作为独立的单系群，依次为：鰤亚科、鲳鲹亚科、鲹亚科，这种聚类关系与形态分类相吻合。目前中国对于丽叶鲹与及达副叶鲹的属种定名较为混乱，一定程度上说明了分类系统仅仅依赖传统形态学有一定的缺陷。朱元鼎等［1］在东海鱼类志中，将丽叶鲹Caranx（Atule）kalla（Cuvier et Valenciennes，1833）与及达叶鲹Caranx（Atule）djeddaba（Forskal，1775）（即及达副叶鲹）归为一属——叶鲹属，这种观点与成庆泰等［22］编制的《中国鱼类系统检索》一致，而刘瑞玉等［23］编制的《中国海洋生物名录》中，将丽叶鲹Atule kalla Cuvier，1833归于叶鲹属，将达副叶鲹Alepes djedaba（Forsskål，1775）归于副叶鲹属。以上的分类均以形态学为基础，而鱼类在不同生长周期内会有一定程度的形态变化，包括体型和眼睛等；变化原因可能是环境变化导致鱼类在外在形态上发生较为明显的变化［24］，但是其遗传物质尚未发展到可以将两者区分与形态上那样明显，从而出现分类不明确的现象。图2中可见，丽叶鲹与及达副叶鲹以极高的支持率聚在一起（Posterior probability支持率为99），两者K-2-P的距离为0.078，属于种间距离，这与朱世华等［25］得出的结论相同，也用数据验证了WoRMS中将丽叶鲹的学名更为Alepes kleinii（Bloch，1793）与及达副叶鲹的学名更为Alepes djedaba（Forsskål，1775）的合理性。

赵盛龙和钟俊生［7］提出，整个舟山海域有鲹科鱼17种，隶属于11属，其中5个物种仅出现在文献，未获得其样本（高体若鲹、六带鲹、及达副叶鲹、红鳍圆鲹、颌圆鲹）。根据BOLD建议和聚类关系，本次研究在普陀海域共发现8种鲹，其中5个物种已被舟山海域鱼类名录新考记载，另外3种鲹，红尾圆鲹（无斑圆鲹）Decapterus kurroides akaadsi Cuvier，1833、少耙若鲹Carangoides hedlandensis Whitley，1934、小斑鲳鲹Trachinotus baillonii Lacepede，1802没有出现在2005年的舟山群岛鱼类调查报告中［7］，因此我们建议把这3种列为舟山群岛近海海域的新记录种。

致谢：感谢顾翠平、严安琪、Jamel Tyso James在采样和分析过程中提供帮助。

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DNA Barcoding Carangids in Putuo Sea

XU Ze-tan，WANG Hong-ping，GU Han-mei，et al
（Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

Putuo Sea is rich in fishery resources and provides unique advantages for studying the fish diversity.Carangids are commercially important marine species that are widely distributed across tropical，subtropical and temperate waters，including Putuo Coastal Sea.In this study，we used mitochondrial COI DNA sequences to analyze 18 carangids from offshore of Putuo islands.Results revealed a total of 12 haplotypes that belong to 8 species of 7 genera，and three of them is recorded in the first time in the area.With additional homologous sequence data from GenBank，NJ and Bayesian trees showed 18 species of 12 genera.The trees allow us to visually evaluate the phylogenetic relationships and taxonomic status of the species.DNA barcoding complements the deficiencies in traditional taxonomy and classification of carangids，and improve our understanding of the species diversity in Zhoushan waters；Therefore，it provides scientific theoretical framework for the local mariculture and marine conservation.

Putuo sea；Carangidae；DNA barcodes；species diversity

表1　普陀海域鲹科样本和GenBank下载的鲹科COⅠDNA 序列信息（采样地的编号见图1）Tab.1　CO I DNA sequence information of Carangidae for samples collected from Putuo Sea and downloaded from GenBank （See codes of sampling locality on Fig.1）

表2　基于COI 基因片段序列变异的鲹科鱼种内、种间及属间的K-2-P 遗传距离Tab.2　Intraspecific and interspecific K-2-P genetic distances among samples of Carangidae based on CO I DNA sequences

Q959.483

A

1008-830X（2015）02-0105-07

2014-08-24

浙江海洋学院留学回国人员启动基金；浙江省舟山市博士（后）联谊会重点项目基金；浙江省临海市社科联基金（13YB01）

许则滩（1991-），男，浙江苍南人，硕士研究生，研究方向：海洋生物学.E-mail:xuzetan@163.com

陈永久.E-mail:yongjiuchen@hotmail.com