利用散射光声微分成像技术实现弱吸收物质显微成像

黄敏芳，唐志列，2，3，吴泳波，2，3

（1.华南师范大学物理与电信工程学院，广东广州510006；2.广东省量子调控工程与材料重点实验室，广东广州510006；3.广东省光电检测仪器工程技术研究中心，广东广州510006）

利用散射光声微分成像技术实现弱吸收物质显微成像

黄敏芳1，唐志列1，2，3，吴泳波1，2，3

（1.华南师范大学物理与电信工程学院，广东广州510006；2.广东省量子调控工程与材料重点实验室，广东广州510006；3.广东省光电检测仪器工程技术研究中心，广东广州510006）

光声显微成像技术依赖于样品的内源性光吸收，对强散射弱吸收样品成像效果差，甚至无法进行成像。为了实现强散射弱吸收高透明生物样品的光声显微成像，以及获得图像的边缘增强效果，使光声显微成像技术在实际的生物医学研究中更有应用价值，本文首次将散射光声技术引入到光声微分显微技术中，研制了新型的散射光声微分成像技术。该技术不仅可以获得强散射弱吸收高透明生物样品的散射光声显微图像，还可以获得对应的边缘清晰的散射光声微分图像，对在生物医学研究领域有重要的应用意义。

光声显微术；边缘增强；散射光声技术；空间微分技术

0 引言

微分显微技术具有增强边缘与突出微细结构的优势［1，2］，而光声显微镜具有实现高对比度与高分辨率的免标记功能成像的优势［3-5］，将这两种技术结合形成一个新的技术--光声微分显微技术，可将二者的优势结合，在对样品进行高对比度与高分辨率免标记光声成像的同时，实现边缘的增强与微细结构的突出［6］。然而，光声微分显微镜技术无法对强散射弱吸收样品进行成像，因为其是基于传统的光声显微镜技术，依赖于样品的内源性光吸收，而强散射弱吸收样品的光吸收非常弱，产生的光声信号太弱无法实现有效探测［3，7，8］。由于在实际的生物医学研究中，肿瘤细胞或癌细胞等的生长形态、生长和繁殖等是研究的热点内容［9，10］，而这些细胞样品一般都是光吸收能力差。因此，为了使光声微分显微技术能够实现强散射弱吸收样品的光声显微成像以及获得边缘增强效果，本文在光声微分技术的基础上引入了散射光声成像技术，利用该技术获得了强散射弱吸收细胞的高对比度的光声图像，以及边缘清晰的散射光声微分图像，使得光声成像技术应用在生物医学研究领域中更具意义。

1　散射光声微分的原理

散射光声微分显微镜技术本质上是在散射光声显微镜技术的基础上引入空间微分技术。散射光声显微镜技术是采用光声探测技术探测被强散射弱吸收样品散射的光子，再将光信号转化为电信号，通过采集与处理电信号，重构样品的散射光声显微图像。而空间微分技术是利用空间互补调制的方法将入射光束I调制成两束强度相同、相位相反的光束，这两束调制光束的表达式分别为I1（t）=I0cos（ωt）与I2（t +△t）=I0cos（ωt+π），再使入射激光连续扫描，实现两束调制光束到达样品上的空间两点距离足够小，即实现△x→0。

由于在散射光声显微镜技术中，探测到的光声信号是来自样品的散射光声信号与样品自身吸收产生的光声信号的叠加，但由于强散射弱吸收样品自身光吸收很弱，光散射很强，故探测到的光声信号主要是散射光声信号，而散射光声信号与样品的散射光强度I成正比。因此，当两束光I1、I2先后聚焦到样品的某一点产生散射光声信号后，光声探测器接收到的散射光声信号为：

其中C是与实验条件有关的常数，a（x）是样品的光散射系数。由上式可知，互补调制技术实现了强散射弱吸收样品的散射光声信号的差分。

根据数学推导，光声探测器最后探测到的散射光声微分信号即散射光声信号S（x）对样品上对应空间位置x的微分，可表示为：式中S（x+△x）和S（x）分别代表成像样品在x+△x和x处产生的散射光声信号。

当样品上相邻两点的散射光声信号强度相同时，光声探测器探测到的信号强度为零，当相邻两点的散射光声强度不相同时，则光声探测器探测到一个不为零的散射光声信号。在样品的边缘位置或有变化结构位置时，空间相邻两点的散射光声信号差异较大，因此散射光声微分显微成像技术能实现强散射弱吸收物质的边缘信号提取，实现边缘增强。即散射光声微分显微镜技术可以实现强散射弱吸收物质的微分图像即边缘增强的散射光声显微图像的获取。

2　实验装置

如图1，散射光声微分显微成像系统主要是由风冷氩离子激光器（波长为514.5nm，Argon ion laser，35LAL515-230，CVIMelles Griot）、互补光调制器、振镜驱动器（6231C，Cambridge Technology）、微腔散射光声探测器、前置放大器、锁相放大器（SR830，Stan-ford Research Systems）、数据采集卡（PCI6115，Na-tional Instrument）、以及计算机构成。其中，互补调制器、微腔散射光声探测器和前置放大器为本课题组自主研发。

图1　散射光声微分显微成像系统原理图Fig.1 The experimental setup of scattering photoacoustic differentialm icroscopy

氩离子激光器输出的激光被半透半反镜分束后，经互补调制器调制成强度相等、相位相反的两束光。两束调制后的光再次聚合，入射到振镜驱动系统，出射后被显微物镜聚焦在成像物体上。样品所激发的散射光声信号被微腔散射光声探测器所探测，由于探测到的散射光声信号十分微弱，因此，利用自行设计的前置放大器对光声信号进行预放大，接着使用锁相放大器对被调制的光声信号进行解调并进一步放大。利用互补调制器，微腔散射光声探测器探测到的是成像物体上相邻两点的微分散射光声信号。将该信号输送到数据采集系统中，通过计算机算法可以重建出成像物体二维空间分布的散射光声微分显微图像，即散射光声微分显微图像。

3　实验结果与分析讨论

3.1光声微分显微成像

为了验证利用互补调制技术结合激光扫描技术能够实现光声微分，实验采取标准分辨率板（JJG 827-1993，RTA-07）作为成像物体。显微物镜的放大倍数为50×（NA=0.65），实验过程中，我们对分辨率板上的同一目标分别利用光声微分显微、光声显微镜和光学显微镜成像，实验结果如图2所示。

图2　分辨率版成像。（a）光声微分图像；（b）光声图像；（c）光学显微镜图像Fig.2 Images of resolution plate：（a）photoacoustic differential imaging；（b）photoacoustic imaging（c）opticalmicroscopy

图2（a）是分辨率板的光声微分图像，即边缘增强光声显微图像，图2（b）是对应的光声图像，而图2（c）则是对应的光学显微图像。从图2（b）和（c）可看出，光点入射于分辨率板上的暗区时产生强光声信号，光点入射于透明区则产生弱光声信号。分辨率板的光声显微图像2（b）和对应的光声微分显微图像2（a）结构清晰，对比度高。在分辨率测试板中，当空间上连续被扫描的两点是在分辨率板中的暗区或透明区上，这两点对应的光吸收系数相等，产生的光声信号相等，微腔散射光声探测器的输出为零；如果连续被扫描的两点处于暗区或透明区的边缘位置，它们对应的光吸收系数不等，产生的光声信号不能相消为零，则微腔散射光声探测器就会输出一个脉冲信号，用锁相放大器把该脉冲信号检测出来，用该信号进行成像，经过计算机处理就可以得到光声微分图像。综上所述，利用互补光调制器结合激光扫描技术，可以成功实现光声显微镜微分成像。

3.2散射光声显微成像及散射光声微分显微成像

为了验证散射光声微分显微镜系统能实现强散射弱吸收样品的成像，获取样品微分图像即边缘增强的散射光声显微图像的可行性，以强散射弱吸收的口腔上皮细胞作为样品进行实验，实验采用40×（NA=0.65）的显微物镜，实验结果如图3所示。

图3　口腔上皮细胞成像。（a）散射光声微分图像；（b）散射光声图像；（c）光学显微镜图像；（d）图（a）标示位置的数据图像；（e）图（b）标示位置数据图像Fig.3 Images of oral epithelial cell：（a）photoacoustic differential imaging；（b）scattering photoacoustic imaging；（c）opticalmicroscopy；（d）signals image at the sections highlighted in Fig.3（a）；（e）signals image at the sections highlighted in Fig.3（b）

图3（a）是口腔上皮细胞的微分图像，即边缘增强散射光声显微图像，图3（b）是对应的散射光声显微图像，而图3（c）则是对应的光学显微图像。实验得到的图像充分证明了我们提出的散射光声微分显微镜系统不仅能获得强散射弱吸收生物细胞的散射光声图像，图像清晰，而且还能同时实现微分成像，获取边缘增强的光声显微图像。从图3（a）可以看出，微分图像中细胞边缘轮廓非常清晰突出，边缘增强效果很好。相比于光学显微图像，我们得到散射光声图像与微分图像的细胞结构均与光学显微图像一一对应，但由于口腔上皮细胞较为透明，一般的光学显微镜所成的图像对比度很低，而我们所得到的散射光声图像与微分图像均比光学显微图像清晰，图像对比度高。图3（d）和图3（e）分别对应图3（a）和图3（b）白色箭头所表示区域的信号强度。由此可知，对强散射弱吸收样品，应用散射光声微分显微成像技术比起散射光声显微成像能获得的边缘增强效果。

4　结论

利用散射光声成像技术可以实现强散射样品的光声显微成像，获得高对比度的光声显微图像；将光声微分技术与散射光声技术结合，可以实现光声显微图像的边缘增强，获得边缘清晰的光声显微图像。利用散射光声微分成像技术实现了弱吸收生物细胞的光声微分成像，获得了边缘清晰的弱吸收细胞的光声显微图像。该技术对强散射弱吸收物质的显微成像具有重要意义，在生物医学领域将有很大的应用潜力。

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Scattering Photoacoustic Differential Microscopy of Weak Absorbing Material

HUANGMinfang1，TANG Zhilie1，2，3，WU Yongbo1，2，3
（1.School of Physics and Telecommunication Engineering，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Laboratory of Quantum Information Technology，South China Normal University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；3.Guangdong Provinval Engineering Research Center for Optoelectronic Instrument，Couth China Normal University，Guangzhou 51006，Guangzhou，China）

Depending on endogenous optical absorption of sample，photoacoustic microscopy for the strong scattering weak absorbing samp le is difficult.In order to realize the photoacoustic microscopy of strong scattering weak absorbing biological samp le，and obtain the edge enhancement image，which make the photoacoustic m icroscopy technique has meaningful application value in biomedical research，this paper firstly combine the scattering photoacoustic technique with the photoacoustic differentialmicroscopy and develop a novel scattering photoacoustic differential imaging technique. This technique can not only obtain scattering photoacousticmicroscopic images of strong scattering weak absorbing biolog-ical sample，but also obtain the corresponding scattering photoacoustic differential images with clear edge.This tech-nique has important application significance in the field of biomedical research.

Photoacoustic microscopy；edge enhancement；scattering photoacoustic technique；spatial differential technique

O438

A

1007-7146（2015）03-0232-05

10.3969/j.issn.1007-7146.2015.03.004

2015-01-12；

2015-03-08

国家自然科学基金（61178086）；广东省自然科学基金重点项目（S2013020012810）

黄敏芳（1989-），女，华南师范大学物理与电信工程学院硕士研究生，主要从事光声成像方面的学习和研究

唐志列（1963-），男，博士，教授，博士生导师，主要从事光声成像和激光共聚焦显微镜等方面的研究。（电子邮箱）tangzhl@scnu.edu.cn