牛磺熊去氧胆酸联合柳氮磺胺吡啶对小鼠结肠炎模型的药效作用及机制

贾立伟，李 欣，朱文娅，孙 涛,第二军医大学海军临床医学院，北京 00048；海军总医院 消化内科，北京 00048

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)作为炎症性肠病的一种，表现出许多免疫学疾病特征，与细胞和体液免疫均有关联[1]。主要临床表现为反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便，有进展为结肠癌的风险。一些并发症如中毒性巨结肠、肠穿孔等严重影响了患者的生活质量。目前临床上常用的药物为氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂及单克隆抗体。然而这些药物不良反应多，使临床应用受到限制，如5-氨基水杨酸虽然耐受效果较好，但有肌肉抽筋、腹部绞痛、发热、皮疹、肾损伤等不良反应。国外文献报道牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)、熊去氧胆酸在肠道有抗炎作用，减少小肠炎性渗透和氧化应激，调节炎性因子表达，缓解TNBS诱导的小鼠结肠炎[2-3]，但对此尚有争议[4]。本研究旨在观察TUDCA联合SASP对小鼠实验性结肠炎的干预效果，并探讨其可能的作用机制。

材科和方法

1 主要试剂和药品 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)(分子量为36 000 ~ 50 000，粉剂，100 g/瓶)购于美国MP公司；牛磺熊去氧胆酸、柳氮磺胺吡啶购于海军总医院；邻联甲苯胺购于上海万疆生物技术有限公司；小鼠抗体及试剂盒均购于北京博鳌森生物技术有限公司。

2 实验动物 健康雄性8 ~ 9周龄Balb/c小鼠50只，清洁级，体质量(21.7±2) g，购自海军总医院实验动物中心。室温条件下常规饲养。

3 动物分组与处理 适应性喂养1周后，50只雄性Balb/c小鼠随机分为5组，每组10只。分别为正常组、模型组、TUDCA组、SASP组、联合组。正常组自由饮用蒸馏水，余4组小鼠自由饮用5%DSS溶液，7 d建立实验性结肠炎模型[5]。造模前1 d，正常组、模型组给予0.2 ml 0.9%氯化钠注射液，SASP组、TUDCA组分别给予TUDCA(100 mg/kg)、SASP(500 mg/kg)，联合组给予TUDCA(100 mg/kg)+ SASP(500 mg/kg)，药物溶于0.9%氯化钠注射液中，配成0.2 ml溶液，通过小鼠灌胃针灌胃方式注入药物，1次/d。

4 观察指标 1)小鼠的一般情况：按照Murano等[6]标准，进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)积分评定，每日称量小鼠体质量，记录粪便性状并行隐血试验。2)组织学损伤评分：显微镜下对每个切片随机选取10个以上高倍视野(400倍)，按照病理组织学损伤评分标准[1]，取平均值作为组织学损伤计分。3)血清TNF-α、IL-6浓度：造模7 d后，通过眼眶后静脉采血，3 000 r/min离心机分离血清10 min，-20℃冷藏，ELISA法检测TNF-α、IL-6表达。4)结肠组织Hes1、ATOH1、CDX2的表达：麻醉小鼠后处死，剥离全段结肠，测量肛门距回盲部的长度，0.9%氯化钠注射液冲洗后，取病变明显处结肠组织40 g/L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm切片，HE染色。免疫组化SP法检测小鼠结肠组织Hes1(细胞质+细胞核)、ATOH1(细胞质+细胞核)、CDX2(细胞核)的表达。其中以PBS代替一抗作阴性对照。结果判断以出现棕黄色颗粒为阳性，计算机图像分析系统自动记录阳性细胞平均光密度。

5 统计学处理 使用SPSS19.0统计软件，计量资料以-x±s表示，符合方差齐性的计量资料采用单因素方差分析，不符合的采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠一般情况 正常组小鼠精神状态、饮食、活动及粪便均正常，体质量略有增加。模型组小鼠3 d后逐渐出现反应迟缓、竖毛、嗜卧扎堆、黏液血便等表现，同时伴有不同程度的体质量减轻。药物组小鼠上述症状出现较晚，症状相对模型组较轻。

2 结肠长度的改变 与正常组相比，余4组小鼠结肠长度均缩短，各药物组缩短程度比模型组轻，差异有统计学意义(P＜0.01)；药物组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

3 DAI计分 造模第3天，与正常组相比，模型组小鼠DAI评分显著增高(P＜0.05)，说明造模有效。各药物组和模型组比较，DAI积分有所下降，造模第5天开始有统计学差异(P＜0.01)；造模第7天，TUDCA、联合组差异有统计学意义(P＜0.05)，说明TUDCA/SASP联合用药比单用TUDCA缓解效果更好；TUDCA、SASP组差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1。

4 组织学损伤评分 光镜下结肠组织病理可见模型组结肠黏膜糜烂脱落，炎性细胞浸润，腺体不完整，隐窝破坏，杯状细胞减少或消失(图2)。与模型组比较，药物组黏膜损伤程度轻，炎症细胞浸润、糜烂溃疡少，组织学评分差异有统计学意义(P＜0.01)；TUDCA、SASP组和联合组比较，联合组炎症损伤轻，差异有统计学意义(P＜0.05)；TUDCA、SASP组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

5 血清中TNF-a、IL-6的表达 模型组小鼠血清TNF-α、IL-6高表达，各药物组与模型组比较表达相对较低(P＜0.05)。TUDCA、SASP组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图 1 各组小鼠DAI评分Fig. 1 Disease activity index (DAI) score of mice in fi ve groups (aP＜0.01)

6 小鼠结肠组织Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白表达与模型组比较，正常组小鼠结肠Cdx2、Atoh1含量高(P＜0.01)，TUDCA、联合组干预后，能增加其表达量(P＜0.01)。而Hes1在正常组表达较少， 模型组表达显著增加，TUDCA、联合组干预后，能抑制其表达(P＜0.01)。见表2。

表1 各组小鼠结肠长度、组织学损伤评分及血清TNF-α、IL-6表达Tab. 1 Colonic length, histological injury score and the expression of serum TNF - α, IL-6 of mice in fi ve groups(-x±s)

表2 各组小鼠结肠组织Hes1、Atoh1及Cdx2蛋白的表达Tab.2 Expression of Hes1, Atoh1 and Cdx2 protein of colon tissue in mice in fi ve groups (-x±s)

讨 论

本研究观察了牛磺熊去氧胆酸对DSS诱导的结肠炎实验模型的干预效果，此结肠炎模型类似于人类溃疡性结肠炎，广泛应用于治疗方法和潜在的抗炎药物的评估。胆汁酸释放入肠道后，大部分在末端回肠被重吸收，但每次肠肝循环后，约30%的胆汁酸进入大肠。进入大肠的胆汁酸由于肠道菌群的影响，物理化学性质发生了显著改变，包括早期解离、脱羟基、脱磺化。炎症性肠病存在微生态失调，而这与胆汁酸的代谢障碍密切相关，尤其是减少了次级胆汁酸的水平，而亲水的次级胆汁酸具有细胞保护功能[7-9]。国内外广泛研究的次级胆汁酸是牛磺熊去氧胆酸，在人体中含量甚微，长期用来治疗某些类型的胆汁淤积及原发性胆汁性肝硬化。已有报道证明其有效成分具有抗炎活力[4]。TUDCA能够阻碍炎症刺激诱导的内质网应激，许多学者推荐其作为UC新的治疗选择。本实验进一步证明了TUDCA能有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎模型的病变程度。造模1周后，药物组体质量下降、结肠长度减少、疾病活动指数评分、病理组织学评分等指标显著改善，其中联合组效果最明显，说明TUDCA联合SASP可能具有协同效应。

TNF-α是IBD病理进程中的关键细胞因子，通过表达黏附分子、成纤维增殖因子、凝血因子，以及启动细胞毒性反应、凋亡和急性期反应等过程发挥作用[10]。TNF-α的血清水平与UC和克罗恩病(Crohn' s disease，CD)的临床活动有关[10]。目前TNF-α是溃疡性结肠炎一个重要的治疗靶点。几种TNF-α抗体已应用于炎症性肠病治疗，取得了良好的效果[11-12]。IL-6改变出现在急性炎症状态，如风湿性关节炎、炎症性肠病、肾小球肾炎等。IL-6主要通过STAT3信号通路在UC的发病，及随后的UC相关结肠癌肿瘤中发挥重要作用[13]。本研究通过DSS诱导小鼠结肠炎模型，小鼠血清TNF-α及IL-6水平显著提高，TUDCA能降低血清TNF-α、IL-6水平。这些结果表明，TUDCA可能通过抑制炎性因子TNF-α、IL-6减轻结肠炎病变程度，与国外报道同类药物的效果相似[14-15]。

Cdx2是一种调节上皮功能相关基因的重要核转录因子，并控制肠道上皮细胞的分化和增殖。近期一项研究表明，Cdx2在溃疡性结肠炎中的表达减少，Cdx2的抑制导致了溃疡性结肠炎中杯状细胞的消耗[12]，结果在活动性UC中，黏蛋白合成障碍，黏液层变薄或消失。Notch分子信号通路在细胞的分化中起到了重要的作用，Notch信号的激活导致其重要下游基因Hes1上调以及Atoh1(一种与Notch信号通路相关因子)下调，继而抑制干细胞分化为杯状细胞[16]。Atoh1是肠道特异基因Muc2的重要的转录激活因子。Tamagawa等[17]报道胆汁酸可以抑制Hes1，并上调Atoh1增加Cdx2表达，从而导致食管鳞状上皮向柱状上皮的转化。本研究显示，实验性结肠炎小鼠结肠组织Hes1蛋白表达水平明显高于正常组，Atoh1、Cdx2蛋白的表达下降。TUDCA能够减少Hes1蛋白表达水平，增加Atoh1、Cdx2蛋白表达量，进一步说明了胆汁酸、Notch信号通路、Cdx2之间的关系。SASP是经典的氨基水杨酸制剂，可抑制过氧化物酶活性，减少TNF-α刺激产生的IL-l、IL-8等细胞因子的释放与分泌[18]。本研究也证实了SASP能降低小鼠结肠炎血清炎性因子的表达。总之，在小鼠实验性结肠炎的发病过程中，激活了Notch信号通路，抑制了黏蛋白的合成。TUDCA能有效缓解结肠炎症状，改善肠道组织病理。与SASP可能存在协同作用，联合用药可能优于单独用药。

综上所述，牛磺熊去氧胆酸联合柳氮磺胺吡啶可通过不同机制缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，两者具有协同效应。牛磺熊去氧胆酸作用机制可能是通过调节炎症因子、抑制Notch信号传导通路及增加Cdx2蛋白的表达，从而达到对小鼠实验性结肠炎的缓解作用。

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