桃核承气汤对脓毒症大鼠凝血-炎症水平的调控作用研究*

★　黎永琳　　周红　　鲍丹艳　刘云涛　李际强　　（.广州中医药大学第二临床医学院　广州50405；.广东省中医院、广东省中医急症研究重点实验室　广州500；.广东祈福医院　广州5495）

桃核承气汤对脓毒症大鼠凝血-炎症水平的调控作用研究*

★黎永琳1周红2**鲍丹艳3刘云涛2李际强2（1.广州中医药大学第二临床医学院广州510405；2.广东省中医院、广东省中医急症研究重点实验室广州510120；3.广东祈福医院广州511495）

目的：观察血管内皮细胞蛋白C受体（EPCR）对脓毒症大鼠凝血相关因子血清凝血因子XIV（FXIV）活性及炎症相关因子血清白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的影响以及桃核承气汤对凝血-炎症系统的调控作用。方法：将大鼠分为正常组、模型组（脓毒症）、中药组（造脓毒症模型后用桃核承气汤治疗），采用二次打击法建立脓毒症模型，ELISA法检测造模后休克开始及复苏后第72h血清EPCR的表达以及FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，第120h各组IL-6、TNF-α的含量。结果：脓毒症大鼠的EPCR水平，中药组与正常组、模型组之间差异有统计学意义（P＜0.05）；而凝血因子FXIV、IL-1β含量中药组与正常组、模型组之间未见差异（P＞0.05）。脓毒症大鼠造模后TNF-α水平，在第72h时中药组（2.14± 0.55）和正常组（2.04±0.52）与模型组（2.75±0.83）含量有明显差异（P＜0.05），第120h时中药组（3.13±0.52）和正常组（2.77±0.3）低于模型组（3.56±0.56）水平（P＜0.05），且三组TNF-α含量均高于第72h时。结论：桃核承气汤可能通过调节脓毒症大鼠EPCR水平的表达，抑制TNF-α水平，从而调控脓毒症的炎症反应。在脓毒症的凝血-炎症网络中桃核承气汤的调节凝血作用或弱于调节炎症作用。

EPCR；TNF-α；凝血因子FXIV；中药治疗；二次打击法

脓毒症（sepsis）是感染、创伤和烧伤等多种临床危重症的严重合并症。脓毒症不仅表现有失控的炎症反应，而且存在凝血、免疫、细胞增殖等活性的改变，是多系统环节共同作用的结果。蛋白C（PC）抗凝系统不仅具有抗凝活性，而且调整着机体免疫炎症反应功能，脓毒症中PC抗凝活性的下调促进了脓毒症病理过程的进展。血管内皮细胞蛋白C受体（EPCR）是蛋白C抗凝系统主要成分之一。EPCR在脓毒症中亦介导了活化蛋白C（APC）抗炎及细胞保护作用的发挥。因此，对促进严重感染性疾病的治疗，应基于对治疗方式有效评价和分子水平，对凝血-炎症系统间潜在交互反应机制进行深入了解。本研究用桃核承气汤治疗脓毒症大鼠，从EPCR表达、凝血因子XIV（FXIV）及炎症相关因子IL-1β、IL-6水平入手，揭示脓毒症凝血和炎症形成网络并相互促进，内皮细胞的网络枢纽作用的病理生理学机制，从而为脓毒症的中西医结合防治提供新的切入点。

1　材料与方法

1.1动物及分组选用SPF级雄性SD大鼠90只，购自广东省医学实验动物中心，体重200～220g，随机分为正常组、模型组、桃核承气汤中药组3组，各组分别为30只。

1.2仪器与试剂高速冷冻离心机（上海科学仪器厂），标准规格酶标仪（上海将来实验设备有限公司），电热恒温培养箱（昆山东旺精密仪器有限公司）。血清EPCR、FXIV、IL-1β（CSB-E08055r）、IL-6 （CSB-E04640r）、TNF-α（CSB-E11987r）ELISA试剂盒，美国CUSABIO公司生产。

1.3桃核承气汤制备每剂中药煎剂由桃仁12g、大黄12g、桂枝6g、芒硝6g、甘草6g组成，所有药物由广东省中医药中药房提供。上述药物加水100mL，头煎20min，二煎加水100mL煎煮30min，分别滤取药液，合并两次药液，在60℃恒温条件下浓缩成每mL含生药1g的药液备用。水煎剂由广东省中医院中心实验室临床药理室制备。生大黄于浓缩后期放入。

1.4模型制作与取材采用改良的“二次打击法”复制大鼠脓毒症模型［1］。正常组：正常饲养，不做手术处理，只行置管抽血备测，不行失血及液体复苏处置。模型组：采用改良的“二次打击法”复制脓毒症大鼠模型，造模成功后，每隔1h腹腔注射5%葡萄糖盐水（20mL/kg），作为支持治疗，大鼠成活大于24h则可抽血待查。中药组造模手术同模型组，于第一次“失血性休克-复苏”打击后开始经胃管灌注桃核承气汤2mL/kg（分别灌药0.40～0.42mL），1次/8h。在24h前死亡者视为复苏失败，不取样品及检测。造模成功后，各组在造模第3天后，将剩下存活的一半大鼠，从大鼠经腹主动脉采血1.8mL，全血标本于室温放置2h后于1000xg离心20min，取上清检测EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α；另一半大鼠在造模后第5天进行同样的操作后，检测IL-6、TNF-α。

1.5大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量检测采用定量夹心酶联免疫吸附技术（ELISA），分别测定大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。通过用酶联仪在450nm波长依序测定每孔的光密度值（OD值），在加终止液后15min内进行血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α检测，绘制标准曲线，最后计算出大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6统计学处理统计检验采用SPSS18.0软件进行分析，FXIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α水平用均数±标准差（±s）表示。FXIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α各组间比较采用单因素方差分析，如方差不齐的，采用适当的转换后再采用单因素方差分析检验。各组间两两比较采用LSD检验。两个独立样本的比较符合方差齐性者来用独立样本t检验，不符合者采用非参数检验。P＜0.05表示差异具有显著性。

2　结果

2.1各组大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较见表1。三组间凝血因子FXIV、IL-1β含量未见差异（P＞0.05），而EPCR水平互相不一致（P＜0.05），TNF-α水平在第3天时正常组与中药组相近（P＞0.05），模型组与正常组、中药组含量均不一致（P＜0.05）。

2.2各组血清IL-6、TNF-α在第72h、120h的水平比较见表1。在本次实验中，我们对比了正常组、模型组、中药组在第72h、第120h时IL-6、TNF-α水平的差异。结果发现，在第72h、120h，各组血清中IL-6的水平无差异（P＞0.05），但在第72h时，中药组＞正常组＞模型组，第120h时，正常组＞中药组＞模型组；而TNF-α的水平则不一致（P＜0.05），第120h时，各组TNF-α水平均高于第72h时。在整个实验过程中，模型组TNF-α水平均高于正常组、中药组。

表1　血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量一览表

3　讨论

3.1EPCR或能抑制脓毒症炎症反应水平EPCR是蛋白C（PC，抗凝系统组成部分）或活化蛋白C （APC）的受体，PC或APC通过结合EPCR后，进入细胞内，或进入细胞核内发挥抗凝、抗炎作用。依据本次实验结果，我们发现，EPCR、FXIV的水平在正常组大鼠与模型组大鼠之间无差异。我们通过查阅文献发现，尽管都是在脓毒症的模型中，脓毒症组EPCR蛋白的水平和对照组相比，得到的结果不完全一致，有的研究［2-3］发现，脓毒症组的EPCR蛋白水平较对照组下降，有的研究［4］却是发现EPCR蛋白水平较正常组代偿性增加。而我们的实验结果提示，EPCR水平中药组高于正常组，模型组最低。对此我们发现，以上研究在检测EPCR蛋白水平时存在一个检测时间、实验对象的差异，前者是采用脓毒症细胞，在24h、48h时间点进行测定的，后者是采用盲肠结扎-穿孔建立的脓毒症动物模型上，在22h时间点上进行测定。反观我们的实验则是在72h后进行EPCR蛋白水平的测定。针对以上情况，我们猜想：EPCR蛋白水平可能随着机体反应时间的长短在体内有一个波动的情况，在早期以EPCR代偿性增加为主，中期则以下降为主，并逐渐恢复相对正常水平。为此，我们将可以进一步细化我们的实验，并对脓毒症不同时间段EPCR蛋白水平的检测和观察使用了桃核承气汤干预后的EPCR蛋白水平表达的动态演变。

3.2通腑活血法能下调机体脓毒症的炎症反应水平中医学认为，脓毒症为邪毒入侵（严重感染）导致热毒炽盛，毒热入血，血热互结，败血阻滞，瘀血产生，毒瘀并存，最终致出血、休克、昏迷。通腑泻下、活血化瘀是治疗脓毒症的重要措施。肠道是脓毒症启动器官，通腑泻下法多以中药大黄单味或以大承气汤为主治疗内毒素所致肠源性感染。认为外邪与肠中糟粕搏结，腑气不通，胃肠道内G-过度繁殖，菌群比例失调，毒力剧增，是导致肠源性内毒素血症的主要病机。故采用通腑泻下法可以荡涤积滞，抑制过度发酵，解除肠道组织缺血缺氧状态，恢复肠粘膜屏障功能，阻止肠道细菌移位，避免肠源性内毒素的吸收［5-7］。在本次实验中我们发现，中药组的TNF-α水平比模型组的降低，而3组IL-6的水平是相近的，这提示我们桃核承气汤有可能通过下调机体TNF-α水平的表达，以抑制脓毒症炎症水平，达到保护机体的作用。

3.3桃核承气汤可能通过调节机体EPCR的表达，以抑制TNF-α的含量，来达到降低脓毒症炎症的反应水平本次实验过程中我们发现，在正常组、模型组、中药组EPCR表达水平变化的同时，TNF-α的水平也在变化。这提示我们EPCR表达水平与TNF-α水平可能相关。陈友琴等［8］的研究给了我们一个启示，APC能显著抑制TNF-α诱导的细胞因子（IL-1α和IL-8）分泌和黏附分子（ICAM-1，VCAM-1 and E-selction）表达，从而通过抑制炎症因子的产生来调节炎症反应。而EPCR作为APC的受体，APC通过与EPCR结合，从而发挥抑制TNF-α的作用，并通过下级的调控反应抑制脓毒症炎症的进程。而桃核承气汤能够通过调节脓毒症大鼠EPCR水平的表达，从而起到调控炎症的作用。

3.4桃核承气汤或存在调节脓毒症大鼠凝血功能的作用尽管本次实验中3组大鼠凝血因子FXIV的表达没有差异，但杨荣源等［9］的研究发现，通腑活血法能调节脓毒症凝血功能。这可能是因为我们本次实验选用的反映凝血功能水平的指标不大合适。因此我们下一步的实验可以选取不同的凝血指标，在不同时间段，使用桃核承气汤进行干预，以验证临床发现，从而为揭示凝血-炎症网络反应机制提供切入点。

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［9］杨荣源，王大伟，黄宏强.通腑活血法对脓毒症患者凝血功能的影响［J］.广州中医药大学学报，2009，26（4）：321-324.

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广东省科技计划项目（2011B061200038）。

**通信作者：周红（1960-），女，主任医师，教授。Email：zhouhong282@126.com。

（2014-10-10）编辑：万崇毅