化浊行血颗粒对动脉粥样硬化模型大鼠颈动脉炎症因子的影响*

周永红，胡怀强，张　皓

化浊行血颗粒对动脉粥样硬化模型大鼠颈动脉炎症因子的影响*

周永红1，胡怀强2，张皓1

（1.青岛大学医学院中医学教研室，青岛266021；2.中国人民解放军济南军区总医院神经内科，济南250031）

［目的］研究化浊行血颗粒对食饵性动脉粥样硬化（AS）模型大鼠颈总动脉过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）、核因子-κB（NF-κB）的影响，探讨中药治疗AS作用机制。［方法］实验动物按体质量随机分为正常对照组、模型组和药物组，每组12只，采用高脂饲料法建立大鼠食饵性AS模型。药物组给予化浊行血颗粒水溶液，正常对照组、模型组分别给予等容量的蒸馏水，连续8周。实时定量PCR测定PPARmRNA，免疫印迹法观察NF-κB表达。［结果］与正常对照组比较，模型组颈动脉内PPARα、PPARβ及PPARγ含量显著降低（P＜0.01），药物组PPARα、PPARβ及PPARγ含量显著升高（P＜0.01），模型组和药物组NF-κB均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，药物组PPARα、PPARβ及PPARγ含量显著升高（P＜0.01），药物组NF-κB显著降低（P＜0.01）。［结论］化浊行血颗粒可激活PPARα、PPARβ及PPARγ，拮抗NF-κB，从而抑制AS的发生、发展。

化浊行血颗粒；动脉粥样硬化；过氧化物酶体增殖物激活受体；NF-κB

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.04.08

以动脉粥样硬化（AS）为主要病理基础的慢性疾病严重威胁人类健康，已经成为中国的重大公共卫生问题［1］，防治AS具有重要的健康效应和经济效应［2］。AS是一种复杂的血管炎性疾病，炎症反应贯穿其发生、发展的全过程［3］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）可抑制AS形成［4］，核因子-κB（NF-κB）的活化可诱发AS产生并加重其发展［5］。笔者观察了化浊行血颗粒对食饵性AS大鼠颈总动脉PPARs、NF-κB的作用，以期揭示中药复方治疗AS的可能机制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物成年SPF级雄性SD大鼠36只，体质量250～300 g，由山东大学实验动物中心提供，实验动物生产许可号：SCXK（鲁）20090001（山东省科学技术厅发），实验动物质量合格证号：鲁动质号1205215（山东省实验动物管理委员会发），检疫后备用，自由摄食进水。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。

1.1.2实验药物化浊行血颗粒，主要由荷叶、焦山楂、决明子、制水蛭、酒大黄、赤芍、路路通、虎杖、何首乌等组成，由山东鲁信药业有限公司生产（批号：2012031701），并按照成人剂量的20倍［12 g/（kg·d）］将其制成水溶液，浓度为1.2 g/mL（即10 mL/kg），置于4℃冰箱中备用。

1.1.3主要试剂Trizol试剂，Invitrogen life technologies；RNA酶抑制剂、MMLV反转录酶，Epicentre；NF-κB抗体，美国Sigma公司；细胞及组织总蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒，上海康成生物工程有限公司；浓缩型DAB试剂盒，北京中杉金桥生物科技有限公司；Tris，美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1分组方法实验动物购买后，在实验室内适应性饲养1周，1周后按体质量区组化后随机设计分为正常对照组、模型组和药物组，每组大鼠各12只。因灌胃致吸入性肺炎模型组死亡2只、药物组死亡1只。

1.2.2造模方法参照文献［6］建立大鼠食饵性AS模型，AS大鼠（包括药物组和模型组）喂食高脂饲料（配方：3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料），同时在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D 6×105U/kg。对照组按照体质量给予同等体积的生理盐水。连续喂12周。

1.2.3给药方法造模后，药物组灌胃给予化浊行

血颗粒水溶液，剂量为12 g/（kg·d）（相当于70 kg成人每日10倍用量），正常对照组、模型组分别给予等容量的蒸馏水，连续8周。

水利工程启闭机是水利工程上用来开启和关闭闸门、拦污栅等水工金属结构的关键性永久设备，是水利工程不可分割的重要组成部分。水利工程启闭机在运行过程中，由于受到轨道摩擦阻力、泥沙淤积阻力，使其荷载变数增大，甚至可能超过启闭机设计额定载荷，造成安全隐患。因此，启闭机的安全可靠运行直接影响到水利工程安全和社会经济效益的正常发挥，对工程起着举足轻重的作用。其质量的好坏不仅关系着产品本身的使用效果和寿命，也关系着水利工程的安全运行，甚至关乎国家和人民生命财产安危。

1.2.4动物处理与取材给药结束后禁食8 h，100 g/L水合氯醛腹腔注射（300 mg/kg）麻醉动物，分离颈总动脉血管，用生理盐水冲洗后置于多聚甲醛后固定液（含0.1%DEPC）、4%戊二醛溶液中固定，参照文献［7-8］制备颈总动脉提取物，于-80℃冰箱保存备用待测。

1.2.5颈总动脉PPAR mRNA检测采用实时定量PCR法。首先组织匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀等步骤进行RNA抽提及质量检测。然后进行cDNA合成，配制退火混合物及RT反应液，加10 μL的RT反应液到10 μL退火混合物中，37℃水浴60 min，加热到95℃维持5 min，得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。最后进行实时定量PCR检测，制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板，进行Realtime PCR反应，各样品目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应，根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。实时定量PCR使用的引物见表1。

表1　设计引物列表Tab.1　The design of primers

1.2.6颈总动脉NF-κB检测采用免疫印迹法观察。蛋白质抽提，按照BCA蛋白质定量试剂盒说明书操作进行BCA蛋白定量测定。SDS-PAGE电泳：制备分离胶、制备积层胶、样品准备，加入电泳缓冲液，上样电泳，使用BioRad电泳装置，样品首先在80 V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端，然后120 V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部，凝胶电泳于4℃。蛋白转移，膜的封闭和抗体孵育：膜在5%BSA溶液中室温孵育1 h以封闭膜上的非特异结合，封闭过的膜加入一抗体4℃过夜，抗原抗体结合，加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1 h。TKCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育3 min，去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X线胶片曝光，对胶片进行扫描，图片扫描保存为电脑文件，并用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

1.2.7统计学方法所有资料数据用SAS8.1版统计软件进行分析。计量资料采用t检验、q检验；组间比较用单因素方差分析，所用计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示。P为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1对AS模型大鼠颈总动脉PPAR mRNA的影响见表2。

表2　对AS模型大鼠颈总动脉PPAR mRNA表达的影响Tab.2　Effects on the expression of PPAR mRNA in common cariod artery of AS rasts

表2　对AS模型大鼠颈总动脉PPAR mRNA表达的影响Tab.2　Effects on the expression of PPAR mRNA in common cariod artery of AS rasts

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别　n 　P P A R α m R N A 　P P A R β m R N A 　P P A R γ m R N A正常对照组　1 2 　6 . 5 3 ± 1 . 3 4 　2 . 3 2 ± 0 . 3 6 　2 . 8 6 ± 0 . 5 3模型组　1 0 　4 . 2 3 ± 0 . 6 7* 　1 . 6 2 ± 0 . 2 8* 　1 . 9 4 ± 0 . 5 6*药物组　1 1 　9 . 0 1 ± 1 . 1 5 *#　2 . 9 7 ± 0 . 3 3 *#　5 . 3 8 ± 1 . 2 2 *#

2.2对AS模型大鼠颈总动脉NF-κB的影响见表3。

表3　各组大鼠颈总动脉NF-κB表达的变化（x±s）Tab.3　Variation on the expression of NF-κB in common carotid artery of rats in each group（x±s）

3　讨论

AS是一种复杂的血管炎性疾病，炎症反应贯穿其发生、发展的全过程［3］。PPARs是配体活化的核转录因子，分为PPARα、PPARδ（或β）和PPARγ 3种亚型，与AS都有着密切的联系，可通过抑制炎症因子，保护内皮功能，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，以及稳定斑块等方面发挥着干预AS进程及发展的作用［13-15］。研究结果显示，模型组大鼠的颈动脉PPARα、PPARβ及PPARγ含量较正常对照组显著降低，表明PPARs具有抑制AS形成的作用。药物组PPARα、PPARβ及PPARγ含量较正常对照组显著增高，说明化浊行血颗粒具有激活PPARs的作用，药物组PPARα、PPARβ及PPARγ含量较模型组显著增高，说明化浊行血颗粒对PPARs的激活作用优于模型组，清化血浊法可上调PPARs表达。可见，化浊行血颗粒可有效激活PPARs，从而抑制AS形成、发生发展，保护血管内皮。

NF-κB属于Rel蛋白家族，在机体多种生物学活性物质的转录调控过程中均起着重要作用。AS炎症病变过程中炎性细胞的激活和炎性细胞因子的释放与NF-κB的激活密切相关［16-17］。激活的NF-κB进入胞核与相应靶序列结合，调节相关靶基因的转录活性，参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡和自由基损伤等病理生理过程［18］，在形成AS的复杂网络结构中，NF-κB的活化是导致AS一个中心环节［5］，因而对NF-κB进行干预，可有效控制AS的发生和发展。研究结果显示，模型组中大鼠颈总动脉NF-κB较正常对照组明显升高，两者之间有显著性差异，表明高脂饲料喂养可激发大鼠动脉内NF-κB活化，从而诱发、加重AS的发生、发展。药物组大鼠颈总动脉NF-κB较正常对照组升高，但较模型组明显降低，且3组之间有统计学差异，说明化浊行血颗粒可有效抑制食饵性AS模型大鼠颈总动脉NF-κB表达。动脉粥样硬化是心脑血管病变的基础，研究表明化浊行血颗粒可以调控AS的形成与发展。

［1］Heron M，Hoyert DL，Murphy SL，et al.Deaths：final data for 2006［J］. Natl Vital Stat Rep，2009，57（14）：1-134.

［2］蒋立新，李希，李静，等.中国动脉粥样硬化性缺血性脑卒中患者他汀类药物应用现状调查［J］.中华流行病学杂志，2010，30 （8）：925-928.

［3］Hansson G.Immune mechanisms in athersclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21：1876-1890.

［4］ Guan Y.Targeting peroxisome proliferator-activated receptors （PPARs）in kidney and urologic disease［J］.Minerva Urol Nefrol，2002，54（2）：65-79.

［5］ Brand K，Page S，Rogler G，et al.Activated transcription factor nuclear factor-kappa B ispresent in the atherosclerotic esion［J］.J Clin Invest，1996，97（7）：1715-1722.

［6］杨鹏远，芮耀诚，焦亚斌.动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立［J］.第二军医大学学报，2003，24（7）：802-804.

［7］ Mattern HM，Lloyd PG，Sturek M，et al.Gender and genetic differences in bladder smooth muscle PPAR mRNA in a porcine model of the metabolic syndrome［J］.Mol Cell Biochem，2007，302 （1-2）：43-49.

［8］Shannon ED，Shalina SO，Raymond A，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor（PPAR）α expression in T cells mediates gender differences in development of T cell-mediated autoimmunity［J］.The Journal of Experimental Medicine，2007，204（2）：321-330.

［9］王新陆.关于血浊理论在现代疾病谱系中作用与地位的探讨［J］.天津中医药，2011，28（5）：355-357.

［10］王新陆.脑血辨证［M］.北京：中国医药科技出版社，2002：110.

［11］胡怀强，周永红，曹秉振，等.化浊行血丸治疗颈动脉粥样硬化症的临床研究［J］.天津中医药大学学报，2010，29（2）：66-68.

［12］王新陆.论“血浊”与“治未病”［J］.天津中医药，2008，25（3）：177-180.

［13］AhmedW，OrasanuG，NehraV，etal.High-densitylipoproteinhydrolysis by endothelial lipase activates PPARalpha：a candidatemechanism for highdensity lipoprotein-mediated repression ofleukocyte adhesion［J］. Circ Res，2006，98（4）：490-498.

［14］Staels B，Fruchart JC.Therapeutic roles of peroxisome proliferatoractivated receptor agonists［J］.Diabetes，2005，54（8）：2460-2470.

［15］Riserus U，Sprecher D，Johnson T，et al.Activation of PPAR promotes reversal of multip 1e metabolic abnormalities，reduces oxidative stress and increases fatty acid oxidation in moderately obese men［J］.Diabetes，2008，57（2）：332-339.

［16］关晶，曲竹秋，王莎莎.速效救心丸对动脉粥样硬化大鼠干预作用的实验研究［J］.天津中医药，2009，26（6）：486-488.

［17］Schleser S，Ringseis R，Eder K.Conjugated linoleic acids have no effect on TNF alpha-induced adhesion molecule expression，U937monocyte adhesion，and chemokine release in human aortic endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2006，186（2）：337-344.

［18］SunZ，AnderssonR.NF-kappaBactivationandinhibition：areview［J］. Stroke，2002，18（2）：99-106.

（本文编辑：马英，于春泉）

Effect of Huazhuo Xingxue grains on inflammatory factor in the common carotid artery of atherosclerosis rats

ZHOU Yong-hong1，HU Huai-qiang2，ZHANG Hao1
（1.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，China；2.Department of Neurology，The General Hospital of Jinan Military Command，Jinan 250031，China）

［Objective］To explore the effect of Huazhuo Xingxue grains on peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）and nuclear factor kappa B（NF-κB）in the common carotid artery of atherosclerosis rats.［Methods］The rats were randomly divided into control，model，and medicine groups.The medicine group was administrated with Huazhuo Xingxue grains for a course of 8 weeks after the atherosclerosis model rats were established by high fat diet，the control group and model group were taken oral equivolumetric distilled water.PPAR mRNA was measured by real time PCR，NF-κB was measured by western blotting.［Results］The PPARα，PPARβ and PPARγ of model group obviously decreased，NF-κB of model，medicine groups obviously increased，which were significantly difference with the control group（P＜0.01）.The PPARα，PPARβ and PPARγ of medicine group obviously increased，which were significantly difference with the model group（P＜0.01）.NF-κB of medicine group was significantly less than those of model group（P＜0.01）. ［Conclusion］Huazhuo Xingxue grains can active PPARα，PPARβ and PPARγ and resist NF-κB to inhibit the development of atherosclerosis.

Huazhuo Xingxue grain；atherosclerosis；peroxisome proliferator-activated receptor；nuclear factor kappa B

R541.4

A

1672-1519（2015）04-0220-04

山东省自然科学基金项目（ZR2010HM109）；山东省优秀中青年科学家基金项目（2009BSB02208）。

周永红（1966-），女，博士，副教授，主要从事中西医结合治疗神经系统疾病的基础与临床研究。

胡怀强，E-mail：huhuaiqiang@126.com。

（2014-09-28）