七十味珍珠丸对大鼠脑缺血再灌注损伤的抗凋亡作用

朱敏侠，刘晓丽，戎浩，李杨，李捷，贺学，盛业萌

七十味珍珠丸对大鼠脑缺血再灌注损伤的抗凋亡作用

朱敏侠△，刘晓丽，戎浩，李杨，李捷，贺学，盛业萌

目的观察七十味珍珠丸（RNSP）对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及抗凋亡机制。方法采用大脑中动脉阻塞模型，实验分组：假手术组、模型组、溶媒对照组和RNSP组。神经功能缺失评分观察大鼠神经缺失体征，红四氮唑染色测量脑组织梗死面积，及Western blot检测海马组织Bcl-2/Bax比值和caspase-3的蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组大鼠神经缺失体征明显，脑梗死面积明显增加，Bcl-2/Bax比值减小，caspase-3蛋白表达明显升高。而与模型组比较，RNSP组大鼠神经缺失体征明显改善，脑梗死面积减少，Bcl-2/Bax比值增大，caspase-3蛋白表达明显降低。结论RNSP对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，与其上调Bcl-2/Bax比值，减少caspase-3蛋白表达的抗凋亡作用有关。

脑缺血；再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；七十味珍珠丸

缺血性脑卒中是中老年人的常见病、多发病，和心脏病、恶性肿瘤构成人类三大致死性疾病，具有高致死率和高致残率的特点［1-2］。长期以来，众多医务工作者对脑卒中的预防、发病和预后康复进行着专注而持久的研究，一些药物也被广泛地应用于研究当中。藏药七十味珍珠丸的藏文译音为然纳桑培（Rannasangpei，RNSP），是藏医最有代表性的名贵珍宝藏成药之一，是藏医临床治疗各种急慢性脑血管及神经系统疾病最常用的药物［3］。本研究拟观察七十味珍珠丸对缺血性脑卒中发病机制中脑缺血再灌注损伤的保护作用及其抗凋亡机制。

1　材料与方法

1.1实验动物60只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠，40～45日龄，SPF级，环境温度20～23℃，湿度40%～80%，自由饮水饮食。体质量（200±20）g，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2009-0019，购自复旦大学医学院实验动物科学部。

1.2药物与试剂七十味珍珠丸（西藏自治区藏药厂，国药准字Z54020062）。红四氮唑（2，3，5-triphenyltet⁃razolium chloride，TTC，美国 Ameresco公司），兔抗大鼠B cell lymphoma/leukemia 2（Bcl-2）抗体和小鼠抗大鼠Bcl-2 associated X protein（Bax）抗体（1∶1 000；美国Santa Cruz公司），兔抗大鼠caspase-3抗体（1∶1 000；美国Cell Signaling Technology公司），小鼠抗大鼠β-actin抗体（1∶5 000）、HRP标记抗兔抗体（1∶1 000）和HRP标记抗小鼠抗体（1∶1 000；美国Millipore公司）。

1.3仪器大脑中动脉阻塞模型栓线-AAAA级（北京沙东生物技术有限公司），大鼠脑模具（深圳瑞沃德生命科技有限公司），免疫印迹法（Western blot）全套设备（美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统（美国GE公司），凝胶分析系统（上海复日科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1动物预处理给药按照随机数字表法将大鼠分为4组：假手术组、模型组、溶媒对照组和七十味珍珠丸药物（RNSP）组。将七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸馏水稀释（终浓度100 g/L），RNSP组以RNSP 0.1 mL/kg灌胃给药，每天1次，连续7 d，溶媒对照组以蒸馏水灌胃，最后1次灌胃后1 h制作模型。

1.4.2局灶性脑缺血再灌注模型的制备6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位，颈部剪毛，常规消毒皮肤后，参照Longa线栓法［4］并加以改进制备大鼠右侧MCAO模型：先分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉，结扎颈外动脉远心端，近心端穿线打一松结，血管夹暂时夹闭颈内动脉和翼腭动脉，在颈外动脉远心端结扎线和近心端松结之间剪一小口将栓线插入颈总动脉，拉紧松结的线并将远心端剪断，颈外动脉向颈总动脉方向拉直，经颈内动脉插入栓线，插入长度约18 mm（自颈总动脉分叉处算起），再灌注时拔出栓线并结扎颈外动脉断端。本课题选用缺血40 min再灌注24 h的时间点。假手术组插入栓线0.5～1 mm，其余操作同模型组。

1.4.3神经功能缺失评分采用双盲法对各组动物进行评分记录，参照Longa评分法［4］，分五级，0～4分：0分，无神经系统损害症状；1分，不能完全伸直对侧前爪；2分，向对侧转圈；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分录入电脑并进行统计分析。

1.4.4脑梗死面积测量麻醉断头取脑，脑组织于-20℃冷冻约10 min后置于脑模具中，每2 mm冠状位切下，连续取6片脑组织，用0.1 mol/L PBS新鲜配制的2%TTC溶液避光染色30 min，最后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，用Image Pro-plus 6.0（Media Cybernetics，Sliver Spring，MD，USA）图像分析软件测量脑梗死面积，并按如下公式计算：脑梗死面积=（切片中梗死面积/全脑面积）×100%。TTC是检测细胞活性的常用试剂，可被存活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原生成红色物质Formazan，因此，未梗死组织被染为红色，而梗死组织不着色，呈现白色。每只大鼠的第4张脑片的梗死面积纳入统计学分析。

1.4.5Western blot实验取大鼠右侧海马组织称质量，加入裂解液匀浆提取上清，测量蛋白浓度，加入等体积2×load⁃ing buffer后煮沸5 min做变性处理，然后上样跑电泳。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上。将PVDF膜置于封闭液中室温孵育2 h后，加入一抗工作液，4℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次后，加入HRP标记的二抗工作液，室温孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL显影液加于膜上反应2 min，在凝胶成像系统中选择合适的曝光时间进行显影，图像输入凝胶分析系统进行分析并保存数据。

1.5统计学方法实验所有数据均以SPSS 17.0软件进行分析，实验数据以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，组间多重比较采用LSD（方差齐）或Dunnett T3（方差不齐），P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠神经功能缺失体征4组间大鼠神经功能缺失评分差异有统计学意义（F=50.589，P＜0.01，n= 8）。假手术组没有神经功能缺失体征，模型组（2.38±0.18）大鼠神经行为学评分增高，神经功能缺失体征明显。与模型组比较，RNSP组（1.50±0.19）大鼠神经行为学评分降低（P＜0.05），而溶媒对照组（2.50±0.19）差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2大鼠脑梗死面积4组间大鼠脑梗死面积差异有统计学意义（F=65.091，P＜0.01，n=7）。假手术组没有梗死，与模型组（37.24±0.93）%比较，RNSP组脑梗死面积占（22.71±2.79）%，显著降低（P＜0.01），而溶媒对照组脑梗死面积占（35.83±3.10）%，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.3Bcl-2/Bax比值4组间Bcl-2/Bax比值差异有统计学意义（F=10.877，P＜0.01，n=5）。与假手术组（1.00±0.00）比较，模型组 Bcl-2/Bax比值（0.72± 0.06）减小，与模型组比，RNSP组该比值（1.02±0.06）增大（均P＜0.01），而溶媒对照组（0.68±0.07）差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.4caspase-3表达4组间caspase-3表达差异有统计学意义（F=17.191，P＜0.01，n=5）。与假手术组（1.00±0.00）比较，模型组该蛋白表达（1.22±0.04）增多，与模型组比，RNSP组该蛋白表达（0.74±0.10）减少（均P＜0.05），而溶媒对照组（1.30±0.06）差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

Fig.2　RNSP increased ratio of Bcl-2/Bax图2　七十味珍珠丸增加Bcl-2/Bax比值

Fig.3　RNSP decreased protein expression of caspase-3图3　七十味珍珠丸减少caspase-3蛋白表达

3　讨论

缺血性脑卒中的发病原因在于脑的主要供血动脉狭窄或闭塞，疾病发展过程中或后期治疗时局部闭塞的血管再通，从而发生脑缺血再灌注损伤。实验研究中，MCAO模型是模拟缺血性脑卒中的常用动物模型，线栓法制作MCAO模型自1989年Longa报道后广为所用，该模型具有操作简单、损伤小、无需开颅的特点，经过大量的实验研究发现，皮质、纹状体、海马和丘脑等都是易损区［4-5］。鉴于海马对于学习、记忆及脑功能的重要性，本课题采用线栓法制作MCAO模型来观察七十味珍珠丸对缺血性脑卒中的保护作用及发病过程中海马组织凋亡相关蛋白的表达变化。

近年来研究表明，脑缺血再灌注损伤后神经元细胞凋亡是细胞死亡的重要方式［6］。细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制，主要有Bcl-2家族、Fas、C-myc、p53和caspase家族等。目前在缺血/再灌注中研究较多的是Bcl-2家族成员，包括抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-XL，和促凋亡蛋白，如Bad、Bid、Bik、Bax和Bak。它们的许多家族成员都位于线粒体外膜，它们调节细胞死亡的机制可能是与其调节线粒体膜上通透性转换孔，改变线粒体膜的通透性有关。线粒体膜的通透性增加时，细胞色素C可释放入胞浆，并与凋亡激活因子（Apaf）结合引起后者构象改变，最后激活caspase-9，转而激活caspase-3等一系列级联反应，导致凋亡的发生［7-8］。

抗凋亡蛋白Bcl-2分子质量为25～26 ku，人类Bax蛋白分子质量为21 ku，与Bcl-2的同源性为21%，故称Bax为Bcl-2家族成员。Bax是该家族中研究比较深入的，也是最具有代表性的促凋亡蛋白。Bax可与Bcl-2形成异源二聚体或自身形成同源二聚体。当Bax超表达时，自身形成同源二聚体，细胞对凋亡信号的反应增强，细胞凋亡增多，当Bcl-2超表达时，它与Bax形成异源二聚体，凋亡被抑制，因此，Bcl-2和Bax的比值决定了细胞凋亡的敏感性［9-10］。本实验中，与假手术组比，模型组Bcl-2/Bax比值减小，而七十味珍珠丸可增加Bcl-2/Bax比值。

Caspase家族是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，与细胞凋亡关系密切，凋亡的最后实施是通过caspase的激活而实现的，而caspase-3为该级联反应的下游关键因子，在各种启动的凋亡程序中起最后枢纽作用［9-11］。在缺血性脑卒中模型中发现caspase-3明显上调，且在脑缺血及脑缺氧-缺血损伤保护作用的研究中也发现，缺血预处理和药物保护等措施可通过减少细胞色素C的释放和caspase-3的激活来减少神经细胞凋亡［12-14］。本研究结果也表明，模型组海马组织caspase-3表达较假手术组明显增多，而七十味珍珠丸药物组caspase-3蛋白表达减少。

七十味珍珠丸主要由佐太、天然珍珠、天然牛黄、羚羊角、麝香、藏红花等七十余味名贵藏药组成，该药在临床和实验研究中受到广泛关注。在临床应用方面主要是治疗卒中偏瘫、阿尔茨海默病、高血压、癫、脑震荡、风湿性关节炎、植物神经功能紊乱和脑出血等［15-19］。在实验研究方面主要用于镇静［20］、抗惊厥［21］、改善学习记忆［22］、改善微循环血流［23］、抗血栓形成［24］、急性肾性高血压中的降压［25］和脑血管疾病防治［23-24］等方面。脑缺血研究方面显示：七十味珍珠丸对脑缺血疾病有类似阿司匹林的抗血栓作用，且效果强于阿司匹林，对大脑动脉血栓引起的局部缺血所致的行为障碍有改善作用，减少了脑梗死面积以及脑组织的病理学改变，说明该药对脑缺血有保护作用［24］。通过本研究进一步表明七十味珍珠丸可减少神经缺失体征和脑梗死面积，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，该作用与其抗凋亡机制相关，为临床上七十味珍珠丸预防和治疗缺血性脑卒中提供了更坚实的理论依据。

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（2014-06-18收稿2014-10-28修回）

（本文编辑魏杰）

Anti-apoptosis effect of Rannasangpei on brain ischemia and reperfusion injury in rats

ZHU Minxia△，LIU Xiaoli，RONG Hao，LI Yang，LI Jie，HE Xue，SHENG Yemeng
Medical College of Tibet University for Nationalities，Xianyang，Shaanxi 712082，China

ObjectiveTo observe the protective and anti-apoptosis effects of Rannasangpei（RNSP）on brain ischemia and reperfusion injury in rats.MethodsMiddle cerebral artery occlusion（MCAO）model was established and the groups were divided as sham group，MCAO group，vehicle+MCAO group and RNSP+MCAO group.Neuronal deficient signs，brain infarct area，the ratio of Bcl-2/Bax and the expression of caspase-3 were evaluated by neuronal deficient score，TTC （2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride）staining and Western blot respectively.ResultsCompared with those parameters in sham group，the neuronal deficient signs，infarct area and caspase-3 expression increased evidently while the ratio of Bcl-2/ Bax decreased markedly in MCAO group.But in RNSP+MCAO group，the neuronal deficient signs，infarct area and cas⁃pase-3 expression decreased greatly while the ratio of Bcl-2/Bax increased markedly compared with those parameters in MCAO group.ConclusionRNSP may have protective effects on brain ischemia and reperfusion，which is related to its an⁃ti-apoptosis role indicated by upregulation of Bcl-2/Bax ratios and downregulation of caspase-3.

brain ischemia；reperfusion injury；apoptosis；rats，Sprague-Dawley；Rannasangpei

R285.5

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.010

西藏自治区科技厅2010年第二批重点科研项目（藏科发［2010］154号）；西藏民族学院院级科研项目（10myY07）

陕西咸阳，西藏民族学院医学院（邮编712082）

朱敏侠（1982），女，讲师，博士，主要从事脑缺血再灌注损伤研究

△E-mail：zhuminxia2001@163.com