金线莲根茎水提工艺优化研究

王文成 林衍生 连建枝 张丽红

摘要：以金线莲组培苗根茎为研究材料，采用超声波浸提法，选取超声波功率、浸提时间、水提温度为单因素水平，进行多糖、游离氨基酸提取工艺优化研究。结果表明：在超声波功率为89 W、浸提时间为68.5 min、水提温度为79 ℃条件下，试验测得多糖2.45 mg/mL，氨基酸0.61 mg/mL，综合分值0.952，综合评价指标最高。

关键词：金线莲；多糖；游离氨基酸；响应面法；提取工艺优化

中图分类号：TS275.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0287-04

金线莲是我国南方名贵的草药，有着“金草”“神药”的美誉。近年来随着组培技术的成熟，试管苗生产得以迅猛发展，目前组培产品已占市场份额的80%以上。尽管如此，由于其生长周期较长，金线莲价格依旧居高不下。金线莲采用组培方式生产中，试管苗叶片部分常被加工烘干成产品进行出售，根茎部分往往由于加工后成色不好，被大量丢弃，造成极大浪费。因而非常有必要开展金线莲茎和根进行功能性物质提取研究，以提高试管苗生产效益。目前金线莲功能性物质提取研究已有报道，但多是针对金线莲本身进行单项功能物质优化提取等方面研究[1-7]，针对试管苗根、茎进行复合物质提取鲜有报道。本研究从功能性大众饮料生产角度，采用超声波浸提法对金线莲根茎部分浸提，以粗多糖、游离氨基酸含量作为评价指标，优化前处理加工工艺，为今后综合开发金线莲功能性饮料提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为金线莲组培苗的根、茎。葡萄糖、苯酚、硫酸、磷酸氫二钠、磷酸二氢钾、茚三酮、谷氨酸均为分析纯。

1.2 试验设备

紫外可见分光光度计UV-1800PC-DS2（上海美谱达仪器有限公司）；恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）； 真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；自动纯水蒸馏器（上海嘉鹏科技有限公司）；九阳JYL-D055榨汁机（九阳股份有限公司）；KQ-100VDE台式双频数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试液制备 取金线莲组培苗根茎10 kg，清洗后阴凉处沥水12 h，以每份100 g为1组，粉碎研磨后加水定容至1 500 mL，再进行超声波辅助提取。在不同的超声波功率、提取时间、提取温度条件下，抽取金线莲提取液后进行测定，测定重复3次，测量结果取平均值。

1.3.2 多糖测定 采用苯酚-硫酸法[8]进行葡萄糖测定。

葡萄糖标准曲线绘制：精确吸取0.10 mg/mL的葡萄糖工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于20 mL 具塞试管中，补水至1.00 mL；各加入5% 苯酚0.6 mL、浓硫酸6 mL，摇匀冷却，室温放置20 min；以 0号管为空白参比，于490 nm处测定吸光度，每浓度设重复测定3 次。以葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，以吸光度D为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程D=6.437C-0.019（R2=0.991）。

1.3.3 游离氨基酸测定 参照GB/T 8314—2002《茶游离氨基酸总量测定》进行金线莲游离氨基酸测定。

氨基酸标准曲线的制作：分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL氨基酸工作液于25 mL容量瓶中，各加水4 mL、pH值8.0的磷酸盐缓冲液0.5 mL和2%的茚三酮溶液 0.5 mL，再沸水浴15 min，冷却后加水定容至25 mL，测定吸光度（D）并绘制曲线，计算得回归方程D=0.070C-0.021（R2=0.949）。

1.3.4 综合指标 以多糖、游离氨基酸含量值为指标，运用隶属度综合评分法对金线莲根茎水浸提工艺进行综合评分。

l=Ci-CminCmax-Cmin。（1）

式中，Ci为指标值，Cmin为指标最小值，Cmax为指标最大值。

按式（2）进行加权得干燥工艺的综合分S。

S=al1+bl2。（2）

式中，l1为指标1的隶属度，l2为指标2的隶属度，a为指标1的权值，b为指标2的权值。本研究以多糖提取得率为主要指标，游离氨基酸提取得率为次要指标，于是取 a=06，b=0.4。考虑到检测的差异性，以上指标的检测重复3次，测量结果取平均值[9-10]。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 超声波功率对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 将试验条件固定为浸提温度为65 ℃、浸提时间50 min，分别调节超声波功率为60、70、80、90、100 W，过滤后测定提取液中多糖和游离氨基酸的含量。

1.4.2 浸提温度对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 将试验条件固定为超声波功率90 W、浸提时间50 min，分别测试浸提温度为60、65、70、75、80 ℃，过滤后测定提取液中多糖和游离氨基酸的含量。

1.4.3 浸提时间对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 将试验条件固定为超声波功率90 W、浸提温度为75 ℃，分别测试浸提时间40、50、60、70、80 min，过滤后测定提取液中多糖和游离氨基酸的含量。

1.5 响应面试验设计

综合单因素试验结果，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选取超声波功率（x1）、浸提时间（x2）和水提温度（x3）为试验因素，以综合评分为响应值，进行3 因素3 水平响应面分析试验，优化金线莲根茎水提工艺条件。试验因素和水平见表1。

1.6 数据处理方法

采用Design-Expert.V 8.0.5软件对试验数据进行回归分析，多项式模型方程拟合的性质由决定系数R2表达，统计学的显著性用F值检验。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 超声波功率对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 从图1可以看出，随着超声功率的升高，多糖和游离氨基酸的提取均呈现先增大后减小趋势，当超声比功率为90 W时，二者的提取得率均达到最高值，而功率达100 W时，提取效率又略有降低。这是由于在超声波产生的两大效应：空穴效应和热效应中，当超声强度较小时，热效应可以忽略不计，此时超声波功率越高，能量越大，产生的空化气泡越大，细胞壁就被破坏得越完全，相应的细胞内多糖及游离氨基酸的提取得率增大；但随着超声强度的增加，产生的大量无用气泡，增加了声波散射衰减，空化效应削弱，热效应此时起主要作用，这就可能造成细胞内多糖及游离氨基酸的提取得率的降低[11-12]。综合考虑，超声波功率取90 W左右为宜。

2.1.2 水提温度对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 从图2可以看出，在60～75 ℃范围内，随着水提温度的升高，多糖、游离氨基酸提取得率不断升高，并于75 ℃时达到最高值，随后微有下降；多糖在75 ℃过后下降的趋势要比游离氨基酸明显。说明水提温度过高可能导致多糖降解，从而引起提取得率下降，所以浸提温度不宜过高，而游离氨基酸则相对耐受温度要高一些。综合考虑取浸提温度75 ℃左右为宜。

2.1.3 浸提时间对多糖和游离氨基酸含量的浸提影响 从图3可以看出，在浸提时间为40～60 min范围内，随着浸提时间的延长，多糖、游离氨基酸提取得率随着时间的延长而增加。60 min以后，多糖、游离氨基酸先后出现提取得率降低的趋势。这是由于在60 min之前，由于时间较短，多糖、游离氨基酸溶解不充分，故浸提时间与浸提得率呈正相关，而在 60 min 之后，多糖、游离氨基酸在75 ℃温度下长时间浸提出现部分降解，该趋势随着时间的推移对提取得率的负面效应要大于正面效应，因而提取得率不再随浸提时间的延长而显著增加。此外，亦有文献指出长时间的超声波萃取会对提取效果产生不利的影响[12]。单从各指标的提取得率上看，多糖较好的提取时间是在60 min左右，而游离氨基酸则为 70 min 左右。考虑到本试验中多糖的权值要大于游离氨基酸。因此，综合考虑浸提时间设在60 min左右为宜。

2.2 响应面法优化试验结果

在单因素试验的基础上，固定超声波功率90 W、浸提时间60 min、水提温度75 ℃等参数，对金线莲根茎水提工艺进行响应面法优化。

2.2.1 试验结果数据 响应曲面试验方案及试验结果见表2。

2.2.2 响应曲面分析 利用Design-Expert.V 8.0.5软件对试验数据进行回归分析，得回归方程：

S=0.82+0.11x1+0.095x2+0.16x3-0.24x1x2-0.10x1x3+0.11x2x3-0.24x12-0.097x22-0.11x32。

其中S为金线莲根茎水提工艺综合评分响应值，x1、x2、x3 为超声波功率、浸提时间、水提温度编码值。

由方差分析结果（表3）可知，模型项P值等于0.001，表明该模型高度显著，失拟度0.853>0.01，说明该模型可信度高，试验数据与模型不相符合的情况不显著，而且调整确定系数与预测确定系数之差（Adj-R2-Pre-R2）<0.2，说明模型的试验值与预测值相关性较高，模型准确[11，1]。回归方程的R2=0.943 7与校正R2=0.871 4相近，表明金线莲根茎水提工艺综合评分试验值和预测值有较好的拟合度，可用于试验结果的预测[13-16]。从数据上看x3、x1x2对金线莲根茎水提工艺综合评分曲面效应影响极其显著，x1、x2影响显著，而x2x3、x1x3影响不显著，影响金线莲根茎水提工藝的3个影响因素的主次顺序为x3>x1>x2，即水提温度>超声波功率>浸提时间。

图4直观地反映了当水提温度固定时，超声波功率和浸提时间的交互作用。在选定的条件范围内，响应面等高线相对较为密集，坡度较为陡峭，表明响应值（金线莲根茎水提工艺综合评分）对超声波功率和浸提时间交互作用的改变较为敏感，金线莲根茎水提工艺综合评分较高值落在两坐标编码值的中间偏上区域。随着超声波功率的变大或变小，和浸提时间的变长或变短，金线莲根茎水提工艺综合评分值都下降。

2.2.3 水提工艺参数优化 以综合评分为响应值，利用软件对试验数据进行最优化分析，得到当x1=-0.11，x2=0.85，x3=0.70，即超声波功率为88.9 W，浸提时间为68.5 min，水提温度为78.5 ℃时，综合评分最高，达0.961。考虑到实际操作的方便，取超声波功率为89 W、浸提时间为68.5 min、水提温度为79 ℃时，进行验证性试验测得多糖2.45 mg/mL，游离氨基酸0.61 mg/mL，综合分值0.952，试验值与预测值接近，验证了该模型的可靠性。

3 结论

在本试验中根据响应面中心组合设计理论得出：在设定考察的3个因素及考量的区域中水提温度对产品的综合提取效果影响最大，超声波功率次之，浸提时间最小。

建立了金线莲根茎水提工艺的综合分与水提温度、超声波功率、浸提时间的二次多项式回归模型，得到最佳工艺参数。经试验验证，超声波功率为89 W、浸提时间为 68.5 min、水提温度为79 ℃时，验证性试验测得多糖 2.45 mg/mL，游离氨基酸0.61 mg/mL，综合分值0.952，相对误差为 0.93%。试验值与理论值是吻合的，证明了该模型的合理可靠性。

响应面法直观地分析了因素交互项的影响，得出了超声波功率和浸提时间的交互作用对综合分指标影响显著，而其他因素交互作用不显著。

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