水热预处理工艺参数对玉米秸秆组分与酶解效率的影响

李梓木，于艳玲,，孙嘉星，李冬梅，冯玉杰

（1 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150090；2 哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江 哈尔滨 150001）

引 言

利用玉米秸秆等木质纤维素材料生产燃料乙醇具有减轻化石能源环境污染、保证能源安全、避免与人争粮等优点[1-2]。由于木质纤维素材料中纤维素被木质素和半纤维素包裹缠绕且具有很高的结晶度[3]，纤维素直接酶解效率很低，通常不会超过20%[4]。因此，必须通过预处理解除半纤维素和木质素对纤维素的封闭，甚至瓦解纤维素的结晶结构，增加纤维素酶与纤维素的接触面积，才能提高纤维素的酶解效率。

目前所应用的预处理方法中，稀酸预处理是木质纤维素预处理研究得最深入的方法，目前仍被很多人认为是最接近实用化的预处理技术，但是该方法对后续的酶解和发酵设备腐蚀严重，成为规模化应用的瓶颈之一[5-7]；蒸汽爆破方法对设备腐蚀小，但对设备要求高，处理效果不稳定[8]。水热预处理（liquid hot water pretreatment）是利用高温条件下（120～260℃）通过压力将水保持在液态，但水的离子积增加、水呈现酸性的原理进行预处理的一种方法。在预处理过程中，半纤维素中的乙酰基不断被水解为乙酸，乙酸作为催化剂与溶剂水共同催化半纤维素水解[9]。由于水在常温条件下是中性的，因此水热预处理同时兼具稀酸预处理和蒸汽爆破预处理的优点，是一种很有前景的木质纤维素预处理方法[10]。

水热预处理反应装置主要有间歇式和流动式两种[11-12]。流动式水热预处理能够实时将半纤维素、木质素分解产物转移到反应装置之外，解除了产物抑制作用，以及在一定程度上避免木质素分解产物对反应的阻碍作用，但流动式水热预处理对装置要求较高，放大较困难，必须配备能够提供较高压力的输液泵，制作成本较高。间歇式水热预处理方法不能将半纤维素和木质素的分解产物实时转移至装置之外，但设备成本较低，易于放大。间歇式水热预处理目前已应用于甘蔗渣[13]、柳枝稷[14]、大豆秸秆[15]、油菜秸秆[16]等原料。Yu 等[17]采用两步法的间歇式水热预处理桉木后进行酶解，第一阶段水热预处理在180℃下进行20 min，木糖得率为86.4%，第二阶段200℃进行20 min，预处理后的纤维素酶解96.63%。Mosier 等[18]为减少木糖在酸性条件下分解采用控制pH 的间歇式水热预处理方式控制单糖降解。Kim 等[19]通过200℃，15 min 的间歇式水热预处理杨木，添加40 FPU·(g 纤维素)-1的纤维素酶使酶解率从未处理的3%提高到67%。Negro等[20]也以杨木为原料，设定230℃为反应温度，温度升高到反应温度即将反应器冷却至室温以结束预处理，经酶解反应[纤维素酶添加量为15 FPU·(g底物)-1]获得酶解率70%。

玉米秸秆是我国农业生产中剩余的一种重要生物质资源，年产量约为2.1 亿吨，且具有不断增长的趋势[21-24]。不同产地玉米秸秆由于纤维素、半纤维素、木质素及抽提物含量具有差异，其水热预处理的工艺条件也有所不同。多元线性回归分析是建立在大量观测值基础上进行建模的较为有效和简洁的统计学方法，目前尚无应用于水热预处理的因素显著性检验和模型构建的文献报道。通过多元线性回归分析不但能够通过统计运算确定处理温度和处理时间对半纤维素移除率等预处理结果影响的显著性，还可以通过拟合模型对整个工艺条件范围内，实验设计未覆盖到的工艺条件结果进行预测。本文应用间歇式水热预处理产地为黑龙江的高抽提物含量玉米秸秆，对比预处理前后玉米秸秆主要成分（半纤维素，木质素，纤维素）的质量变化，并采用多元线性回归分析处理温度和处理时间对预处理效果的影响（方程拟合度不佳时改为二次方程拟合）。同时考察预处理之后纤维素酶解情况，探讨预处理对纤维素酶解率的影响。

1 实验材料与方法

1.1 材料

玉米秸秆（取自黑龙江省绥化市）经粉碎后全部过孔径2 mm 筛，选取粒度为420～250 μm 的颗粒储存于聚乙烯容器-20℃保存。玉米秸秆成分见表1。成分测定均采用美国可再生能源实验室标准分析方法（National Renewable Energy Laboratory LAP standard analytical procedure）进行。所有测定实验均进行两次，表中数据为测定结果平均值。

表1 玉米秸秆组成成分Table 1 Composition of corn stover (dry mass basis)

1.2 处理温度和处理时间对水热预处理效果的影响

水热预处理是在不锈钢水热合成反应釜(型号：316 L；内径2.54 cm×不锈钢厚0.165 cm，长度11.43 cm) 中进行。反应釜通过油浴（HH-S 油浴锅）加热。反应釜内添加3 g 秸秆（粒径：420～250 μm，含水率4.4%）再加入27 ml 去离子水。反应釜温度达到目标温度时开始计时。通过将反应釜浸入室温水中快速冷却终止预处理。处理温度范围设定为180～220℃，处理时间范围设定为10～25 min。预处理后的固液混合物通过抽滤分离，残留固体以200 ml 热去离子水(80～90℃)洗涤，35℃烘干24 h，保存于-20℃用于成分测定及酶解。

1.3 X 射线衍射分析

实验仪器（德国Brucker D8-Advance 型X 射线衍射仪）采用Cu 靶，石墨单色器，加速电压40 kV，电流40 mA，扫描步长0.02°，扫描速度0.075(°)·s-1，衍射角2θ的旋转范围为10°～30°。木质纤维素物料的相对结晶度CrI(%)通过下式计算[25]

式中，I002为校正后结晶区强度（2θ=22.5°）；Iam为校正后无定形区强度（2θ=18.7°）。

1.4 纤维素酶解实验及酶解率测定

纤维素酶(Celluclast 1.5 L)和β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)购自Sigma 公司（中国，上海）。酶解实验在含有40 μg·ml-1四环素和30 μg·ml-1放线菌酮的0.05 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH 4.8)中进行。50 ml 酶解反应缓冲液，0.01 g 纤维素·(ml缓冲液)-1的酶解底物及纤维素酶和β-葡萄糖苷酶[两酶用量均为15 U·(g 纤维素)-1]置于125 ml 锥形瓶，50℃，150 r·min-1，酶解72 h。酶解结束后取1 ml 酶解样品10000 r·min-1离心5 min，上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤后放入-4℃冰箱保存待测。酶解率以原料秸秆中的纤维素质量为基准进行计算（不考虑固体得率），计算公式如下

预处理后固体葡萄糖得率考虑预处理后固体得率，以预处理后固体质量为基准进行计算，即每100 g 预处理后固体经酶解可获得葡萄糖的质量，计算公式如下

1.5 分析方法

实验中单糖及纤维素、半纤维素、木质素含量的测定依照美国可再生能源实验室标准分析方法进行，应用具备示差检测器的高效液相色谱（Shimadzu LC-10A）进行测定。色谱柱为 BioRad Aminex HPX-87P。色谱条件：去离子水为流动相，流速为0.6 ml·min-1，柱温及检测器的温度设定为80℃。

1.6 统计分析

处理温度和处理时间以及实验结果（半纤维素移除率，木质素移除率，纤维素损失率）应用SPSS（21.0.0.0）进行多元线性回归及方差分析或应用Design expert (8.0.6)进行模型拟合(模型拟合度不佳时)。选取200℃，10～25 min 以及180～220℃，20 min 为变量变化范围，通过敏感性分析比较处理温度和处理时间对评价指标（半纤维素移除率和纤维素损失率）的影响。木质素移除率受处理温度和处理时间影响的敏感度大小通过拟合曲面进行分析。

2 实验结果与讨论

表2（数据均为平均值）中列出了不同条件水热预处理后玉米秸秆的半纤维素移除率（以木糖计）、木质素移除率（以酸不溶木质素计）和纤维素损失率。半纤维素移除率（hemicellulose removal，HR）、木质素移除率（lignin removal，LR）和纤维素损失率（cellulose loss，CL）分别以原料秸秆的木聚糖、酸不溶木质素及纤维素质量为基准计算（不考虑固体得率），计算公式如下

HR=(原料秸秆中木聚糖质量-预处理后秸秆中木聚糖质量)/ 原料秸秆中木聚糖质量×100%

LR=(原料秸秆中木质素质量-预处理后秸秆中木质素质量)/ 原料秸秆中木质素质量×100%

CL=(原料秸秆中纤维素质量-预处理后秸秆中纤维素质量)/ 原料秸秆中纤维素质量×100%

2.1 水热预处理工艺条件对秸秆中半纤维素移除的影响

从表2中可知，玉米秸秆中半纤维素移除率随预处理条件的剧烈程度增大而增大，经210℃，25 min 水热预处理后半纤维素移除率最大为86.0%。多元线性回归分析获得模型表达式为

残差的正态p-p图（图1）显示数据分布近正态分布适用于多元线性回归分析，R2=0.953 说明模型拟合度较好。常数项和两个自变量系数的显著性均小于0.05，说明处理温度(T)和处理时间(t)对半纤维素移除率的影响均为显著。即在水热预处理过程中，处理温度和处理时间均能够显著促进半纤维素的自水解产生乙酸，催化半纤维素水解并溶解于水中，减少预处理之后固体中的半纤维素。另外，敏感度分析所选变量范围内，T和t的敏感度系数分别为βtemperature=0.032 和βtime=0.0061，说明在该范围内与处理时间相比，处理温度的提高更能促进半纤维素的自水解，减少固体中的半纤维素。例如：经200℃，20 min 处理后半纤维素的移除率为61.2%；按5%的幅度提高预处理温度至210℃后（210℃，20 min），半纤维素移除率提高到76.9%；而按25%的幅度延长预处理时间至 25 min 时（200℃，25 min），半纤维素移除率仅提高到74.8%。

图1 半纤维素移除率多元线性回归分析残差的正态p-p 图Fig.1 Normality p-p plot of residuals of hemicellulose removal multiple linear regression model

2.2 水热预处理工艺条件对秸秆中木质素移除的影响

在所选实验条件预处理后秸秆中的木质素质量均未降低，且在预处理温度较高时木质素质量反而有所增加（表2）。其原因可能是部分纤维素和半纤维素在酸性条件下经过脱水、断裂、重排、缩聚或聚合产生了酸不溶的物质。这些物质含有羰基、羧基、苯基及烃链等结构，在测定酸不溶木质素时常导致酸不溶木质素测定含量偏高，因此被称为假木质素[26-29]。应用Design expert (8.0.6)软件采取逐步法进行二次方程回归分析，获得R2=0.9283，p＜ 0.0001(significant)，Lack of fit=0.1381 (not significant) 的模型

表2 不同条件水热预处理后秸秆中半纤维素移除率、木质素移除率、纤维素损失率和固体得率Table 2 Hemicellulose removal,lignin removal,cellulose loss and solid recovery after LHW pretreatment

模型中T和t的p值均小于0.0001，说明处理温度（T）和处理时间（t）对木质素移除率（假木质素生成）均具有显著影响。由图2可知，在所选实验范围内，与处理时间相比处理温度范围内等高线较密集，拟合曲面坡度较大，变化趋势较剧烈，说明处理温度对结果影响更大。即虽然提高处理温度和提高处理时间均能促进假木质素的生成，但提高处理温度促进假木质素生成的作用更强。另外，从图2中可以看到处理温度低于200℃时（180℃和190℃），拟合曲面较为平缓，坡度变化较小且木质素增加量较少（表2）；处理温度高于200℃时，拟合曲面坡度变化较大，等高线较密集且木质素增加量较多（表2）。这种现象可能是由于较高的温度（≥ 200℃）更能促进部分纤维素和半纤维素的脱水、断裂、重排、缩聚或聚合等化学反应生成酸不溶的物质（假木质素）。

图2 木质素移除率方程的拟合曲面Fig.2 Fitting surface of lignin removal equation

2.3 水热预处理工艺条件对秸秆中纤维素损失的影响

随着预处理条件剧烈程度的增大秸秆中纤维素损失也随之增大，经220℃、20 min 水热预处理后纤维素损失率最大为15.3%（表2）。多元线性回归分析获得模型

模型p值为0.000，R2=0.818，残差的正态p-p图（图3）显示数据分布近正态分布适用于多元线性回归分析。处理温度(T)和处理时间(t)对半纤维素移除的影响均为显著（显著性均小于0.05）。敏感度分析所选变量范围内，T和t的敏感度系数分别为βtemperature=0.17 和βtime=0.016。这说明处理温度和处理时间均能够促进秸秆中纤维素水解为葡萄糖，但相同幅度提高处理温度更能促进纤维素的水解，造成纤维素的损失。方差分析显示，处理温度升高到200℃以上时（含200℃）各温度间纤维素损失率差异（200℃以上时p=0.000 ＜ 0.05，180 和190℃时p=0.28 ＞ 0.05）开始显著。从表2中也可以看出，经较低的温度（180 和190℃）预处理后纤维素损失较少，但处理温度和处理时间增大到一定值后，纤维素逐渐水解。这是由于与无定形的半纤维素相比，纤维素具有高度致密的结晶结构能够保护自身不被水解。但处理温度和处理时间增大到一定值（例如200℃、20 min）后，半纤维素自水解产生的乙酸等酸性物质不但催化半纤维素水解也能够催化纤维素的水解。

图3 纤维素损失率多元线性回归分析残差的正态p-p 图Fig.3 Normality p-p plot of residuals of cellulose loss multiple linear regression model

2.4 X 射线衍射分析

玉米秸秆经水热预处理后物料的X射线衍射图谱如图4所示，原料和预处理后样品的衍射峰均在22.5°和16.3°为典型的纤维素图谱。而在18.7°处的峰谷则代表了非结晶结构的组分。水热预处理后玉米秸秆在22.5°处衍射峰强度有明显提高，且峰形变尖，半峰宽有所减少，说明纤维素的结晶度有一定程度的提高。从结晶度上（表3）也可看到这种变化。与氨纤维爆破等[30]预处理不同，水热预处理并不能破坏纤维素的结晶结构，随着处理温度和处理时间的增大结晶度反而有所增加（表3）。这是因为在水热预处理过程中，无定形的半纤维素降解导致原料中纤维素比例增加。

图4 玉米秸秆原料和水热预处理后玉米秸秆的 X 射线衍射图Fig.4 XRD spectra of untreated and liquid hot water pretreated corn stover

表3 玉米秸秆原料和不同水热预处理条件下物料的结晶度Table 3 Crystallinity index of untreated and liquid hot water pretreated corn stover under different conditions

2.5 水热预处理对秸秆纤维素酶解的影响

各条件预处理后的纤维素酶解率及预处理后固体葡萄糖得率如图5所示。未经预处理玉米秸秆的纤维素酶解率仅为9.9%。水热预处理显著提高了玉米秸秆纤维素的酶解率，各条件水热预处理后纤维素的酶解率均有不同程度的提高。经210℃、20 min 水热预处理后玉米秸秆的纤维素酶解率最高为76.2%。预处理后固体葡萄糖得率趋势与酶解率相似，同样经210℃、20 min 预处理后固体葡萄糖得率最高为52.6 g·(100 g)-1。

210℃、20 min 预处理与酶解的质量平衡流程如图6所示。100 g 玉米秸秆经210℃、20 min 预处理后获得固体65 g，其中含有37.1 g 纤维素，酶解后获得葡萄糖34.2 g。100 g 玉米秸秆经210℃、25 min 和220℃、20 min 预处理后固体中分别含有35.4 g 和34.2 g 纤维素，经酶解分别获得32.6 g 和31.0 g葡萄糖。虽然210℃、25 min 和220℃、25 min 预处理后半纤维素移除率更高（表2），空间阻碍和反馈抑制[31]更小，预处理后剩余固体中的纤维素水解（以预处理后固体中纤维素质量计）也较多，但由于纤维素损失率较大（纤维素损失率分别为12.4%和15.3%），纤维素酶解率（以原料中纤维素质量计）和预处理后剩余固体葡萄糖得率均没有获得最高值。

水热预处理增大纤维素酶解效率主要是通过水解半纤维素、减少纤维素酶的空间阻碍和半纤维素的反馈抑制来实现。从图7中可以看出玉米秸秆的酶解率与预处理后半纤维素的移除率具有一定的线性关系（R2=0.8468）。半纤维素移除率越高，纤 维素酶解率也随之升高。经水热预处理的大豆秆及麦秆也具有相同的趋势[32-33]。

图5 各条件水热预处理后纤维素酶解率及预处理后固体葡萄糖得率Fig.5 Cellulose digestibility and glucose yield in pretreated corn stover after liquid hot water pretreatment

图6 玉米秸秆预处理与酶解过程质量平衡流程（预处理条件：210℃，20 min）Fig.6 Flow chart of mass balance during pretreatment and cellulose digestibility for corn stover (pretreatment condition:210℃,20 min)

图7 半纤维素移除率与酶解转化率的相互关系Fig.7 Correlation between cellulose digestibility and hemicellulose removal

3 结 论

（1）拟合模型分析显示：处理温度和处理时间对半纤维素移除率和纤维素损失率均具有正向显著影响，对木质素移除率具有负向显著影响。

（2）敏感度分析显示：200℃、10～25 min 以及180～220℃、20 min 为变量变化范围，处理温度对半纤维素移除率和纤维素损失率的影响显著性均大于处理时间。木质素移除率拟合曲面分析显示：处理温度对木质素移除率的影响显著性大于处理时间。

（3）在所选实验条件下，210℃、25 min 获得最大半纤维素移除率86%，220℃、20 min 预处理后纤维素损失最大为15.3%，同时经220℃、20 min预处理后木质素测定质量增加最大为7.8%。

（4）210℃，20 min 水热预处理后纤维素酶解率最高为76.2%，预处理后固体葡萄糖得率最高为56.2 g·(100 g)-1，提高处理温度和延长处理时间能够使半纤维素移除率进一步增加，但由于纤维素损失量增大导致纤维素酶解率和预处理后固体葡萄糖得率降低。

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