F/F对嗜盐污泥以乙酸钠为底物生产PHB能力的影响

崔有为，冀思远，卢鹏飞，张宏宇

（北京工业大学环境与能源工程学院，北京 100124）

引 言

聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate,PHA）是一类由微生物在不平衡生长条件下过量储存外界碳源形成的细胞内部聚合物。PHA 除了与传统塑料聚乙烯具有相似的特性外，还具有生物可降解性和生物相容性[1]，在医疗、环境、制药等领域有较好的应用前景和开发价值。但是，目前工业化生产PHA 普遍采用纯菌种发酵方式，生产成本很高，限制了PHA 的广泛应用。在过去的10年里，很多学者围绕如何降低PHA 的生产成本开展了研究，例如选择廉价底物（农业/工业废弃物或副产物）[2-6]、混合菌群代替纯菌种生产PHA、开放性PHA 生产等[7-12]。

在近年的研究中，很多学者发现嗜盐菌的很多种属可以积累高含量的 PHA。例如，Halobacteriaceae科的嗜盐微生物可以产生达细胞干重（cell dry weight,CDW）的65%的PHA[1]。Haloarcula marismortui甚至可以利用再生废弃物积累30%的聚羟基丁酸酯（poly-β-hydroxybutyrate,PHB）[13]。除了高的PHA 聚集能力外，与淡水PHA积累微生物相比，嗜盐PHA 积累微生物在开放性PHA 生产和PHA 回收等方面也具有显著的成本优势[1]。目前，对于嗜盐菌合成PHA 的研究还仅仅集中在利用嗜盐纯菌中能高产PHA 的微生物研究上。如果实现嗜盐活性污泥替代纯菌生产PHA，将进一步降低PHA 的生产成本。但是这方面的研究还未见报道。

混合菌生产PHA 普遍采用两步法，第一步实现对高聚PHA 能力菌群的筛选和富集，第二步利用这些富集的种群在碳源过剩的条件下最大化地生产PHA[14]。在两步法工艺生产中筛选出具有高聚PHA 生产能力的菌群是关键，这将直接影响后续的PHA 产率。基于生态筛选PHA 高聚菌群普遍采用“盛宴-饥饿”（F-F，feast-famine）交替的机制。该机制的理论基础是在盛宴期具有PHA 积累能力的微生物可以竞争性地储存碳源，储存的PHA 在后续的饥饿期内作为底物为其存活提供必要的碳源和能源。而非PHA 菌群在F-F 交替的环境中不具有生存优势，最终被选择出系统。F-F 机制的实质是对活性污泥混合菌群施加一个选择压，从而选择和富集出具有PHA 储存能力的优势菌种[15]。在F-F 机制中，盛宴期与饥饿期的周期历时的比值（F/F）是影响这一过程的关键。在活性污泥系统中F/F 是一个间接指标，受到有机负荷、污泥龄、温度等运行参数的影响[7,16-17]。而在嗜盐混合污泥体系，这一选择过程受到盐度和菌群特性等因素影响，将更加复杂。因此，确定F/F 对嗜盐PHA 积累混合菌的选择能力的影响对实现嗜盐活性污泥生产PHA 具有重要的意义。

基于此，本研究利用乙酸钠为底物，以F-F 机制筛选高聚PHA 能力的嗜盐活性污泥，集中探索了在这一过程中不同F/F比对嗜盐活性污泥PHA合成菌的PHA 生产能力的影响，从而为优化嗜盐活性污泥筛选提供有益参考。

1 实验材料和方法

1.1 嗜盐污泥的采集和富集

试验中所用嗜盐污泥采自河北省秦皇岛市某河道入海口底泥。该地为人类活动较为频繁地区。采集的河底淤泥经过反复淘洗得到嗜盐活性污泥[18]，然后将该污泥接种到SBR 反应器中。SBR 反应器采用自制双层玻璃夹心反应器，有效体积为2 L。SBR 外接恒温水浴装置，保证在整个过程中可以对温度进行控制，并配有曝气充氧设备和搅拌设备。SBR 每个周期运行9.25 h。一个周期包括：进水5 min，好氧曝气8 h，沉淀1 h，排水10 min。SRT控制为15 d。进水pH 为6.8～7.2，整个反应过程pH 均在7 以上。好氧阶段充分曝气，溶解氧浓度控制在3 mg·L-1以上。温度为30℃。每天运行一个周期。

选择过程中，先后应用两个高低不同的进水底物浓度，形成两个F/F 的运行阶段。试验用水均采用人工配水，以乙酸钠为唯一碳源。先后应用的进水乙酸浓度分别为644 mg·L-1（乙酸钠895.5 mg·L-1）和1500 mg·L-1（乙酸钠2110.9 mg·L-1），进水氨氮浓度均为30 mg·L-1，其他微量元素和营养成分浓度见表1。在配水中投加硫脲（20 mg·L-1），以达到抑制硝化作用的目的。进水盐度以投加NaCl保持稳定在50 g·L-1。进水乙酸浓度为644 mg·L-1条件下连续运行200 个周期，进水乙酸浓度为1500 mg·L-1的条件下连续运行100 个周期。

1.2 不同F/F 选择下的嗜盐活性污泥的PHA 生产能力

为了验证SBR在F/F选择下的混合菌群的PHA生产能力，在这两个F/F 运行阶段末期，均对嗜盐活性污泥进行PHA 生产能力的实验。实验采用4个完全一致的2 L 锥形瓶，有效体积为1.5 L。取第一阶段筛选得到的嗜盐活性污泥，平均分为2 份，分别放入2 个锥形瓶中，2 个锥形瓶的乙酸浓度分别为1500 mg·L-1和3000 mg·L-1，其他营养元素和微量浓度见表1。取第二阶段筛选得到的嗜盐活性污泥，平均分为2 份，分别放入2 个锥形瓶中，2个锥形瓶的乙酸浓度分别为644 mg·L-1和3000 mg·L-1，其他营养元素和微量浓度见表1。小试运行与SBR 周期运行方式一致。

表1 配水组成Table 1 Component of synthetic wastewater

1.3 分析方法

氨氮和MLSS 采用标准方法进行测定[19]。乙酸含量的测定采用气相色谱分析法（Agilent 7890A 气相色谱仪）[19]。PHA 含量采用内标法进行气相色谱分析[20]，具体操作过程如下：从反应器中取出40 ml泥水混合物，离心弃去上清液，加入2 ml 次氯酸钠消毒液使微生物失活，水洗两遍后冷冻干燥。称取冻干后的污泥干样品25 mg 于具塞消解管中，依次加入2 ml 氯仿、2 ml 苯甲酸钠溶液，于105℃消解20 h，冷却后加入1 ml 去离子水，摇匀、离心，取下层有机相于盛有0.5 g 左右无水硫酸钠的2 ml 塑料离心管中，摇匀，于8000 r·min-1转速下离心5 min，随后取有机相进行气相色谱分析。实验采用单一乙酸作为底物，嗜盐污泥合成的PHA 是单一的PHB，未在PHA 的测量中检出其他组分。

1.4 参数计算方法

实验中的动力学计算依据下面公式进行。

PHA 转化率

PHA 比合成速率

底物比吸收速率

生物质转化率

式中，Tfeast为盛宴期时间，h；PHA0为初始细胞内PHA 含量，mg·L-1；PHAf为盛宴期末期细胞内PHA 含量，mg·L-1；S0为初始乙酸浓度，mg·L-1；Sf为盛宴期末期乙酸浓度，mg·L-1；Xa为反应器中平均生物量，mg·L-1。

2 实验结果与讨论

2.1 F/F ≤ 0.33 期间嗜盐活性污泥连续合成PHB效果

首先采用较低的进水底物浓度（乙酸=644 mg·L-1）对接种的河口底泥进行长期选择和富集。在连续运行的200 个周期内嗜盐活性污泥细胞内储存的PHB 含量变化如图1所示。在低底物浓度条件下，SBR 富集系统连续运行30 d 后，嗜盐活性污泥细胞内PHB 含量由初始细胞干重的1.4%增高到5%，此时的乙酸降解速率也趋于稳定。随着低底物浓度的连续运行，在运行100 d 后嗜盐活性污泥细胞内PHB 含量逐渐增高至细胞干重的20%左右，并在后续100 d 内维持稳定状态。由于采用稳定的进水浓度和SRT，系统对底物的降解速率一直保持稳定。上述结果表明在这样的选择下河口底泥的种群已经趋于稳定。

图1 进水乙酸浓度为644 mg·L-1 的SBR 反应器在连续运行200 d 中的最大PHB 含量Fig.1 Maximum PHB content at end of feast PHBse in SBR reactor operated at influent acetic acid concentration of 644 mg·L-1 during 200 d

图2 进水乙酸浓度为644 mg·L-1 的SBR 典型周期Fig.2 Cycle of SBR operated at influent acetic acid concentrations of 644 mg·L-1

图2为运行100 d 后一个典型SBR 周期内PHB合成以及底物的利用情况。由于氨氮是微生物生长的唯一氮源，氮素直接用于微生物的增殖。乙酸在前2 h 迅速被利用，伴随着乙酸的利用污泥中PHB含量持续上升至细胞干重的17%。在盛宴期，底物降解伴随着PHB 的积累，氮素迅速被用于微生物的增殖。在随后的6 h 内，微生物细胞内PHB 含量逐渐下降，最后降至与初始含量基本相同。而此时氮素的利用速率也明显下降，表明其利用内源碳源进行微生物增殖的速率下降。依据碳源的利用情况可以判断，该过程中盛宴期为2 h 左右，而饥饿期为6 h。嗜盐微生物在盛宴期和饥饿期所呈现的PHB 合成和降解以及微生物增殖的趋势同报道的嗜盐纯菌基本相似[13,21]。在100 周期稳定运行后的周期数据分析中，盛宴期的时间均小于2 h，而饥饿期的时间均大于6 h，所以F/F≤0.33。

2.2 F/F ≥ 1 期间嗜盐活性污泥连续合成PHB 的效果

SBR 富集反应器运行200 周期后，提高其进水底物浓度，进水乙酸浓度变为1500 mg·L-1。在该条件下连续运行的100 个周期内嗜盐活性污泥细胞内储存的PHB 含量变化如图3所示。从图中可以看出，在驯化一开始，嗜盐活性污泥细胞内PHB 含量迅速增至40%～50%，但仅仅维持了10 个周期，从第11 个周期开始细胞内PHB 含量呈下降趋势，到第50 个周期细胞内PHB 含量降至5%左右。在以后连续运行的50 d 里，低的PHB 含量一直保持并稳定。研究结果表明提高乙酸含量在运行初期显著刺激了嗜盐活性污泥对PHB 的积累。但是，长期运行导致其PHB 积累能力的恶化。在该运行阶段，由于显著提高了进水碳源的浓度，从而导致氮源的相对不足。在前期的研究中，普遍认为碳源过剩和微生物生长受限制的条件会促进微生物对PHA 的积累[7-10]，在早期的运行中PHB 含量的升高就是由于这样碳源的过量供给造成的。但是，过高的碳源供给和限制性生长并未促进微生物PHA 菌群的富集。相反，长期的运行导致了其系统的崩溃。

图4是运行50 周期后一个典型SBR 周期内PHB 合成以及底物的利用情况。从图中可以看出，乙酸基本在5 h 内被完全利用。但是，在连续的8 h周期内PHB 含量基本保持稳定，没有出现显著的PHB 积累期和消耗期。在6 h 末，乙酸被完全耗尽。此时的细胞内PHB 含量为细胞干重的9.86%，相对初始净增长2.65%。尽管进水氨氮和F/F≤0.33 期间保持不变，但是氮素利用速率明显增加，表明微生物增殖速率相对较快。在50～100 天期间，乙酸的降解速率保持稳定，最快的降解时间是4 h，导致这期间的F/F≥1。

图3 进水乙酸浓度为1500 mg·L-1 的SBR 反应器运行 100 d 过程中系统内最大PHB 含量Fig.3 Maximum PHB content at end of feast in SBR reactor operated at influent acetic acid concentration of 1500 mg·L-1 during 100 d

图4 进水乙酸浓度为1500 mg·L-1 的SBR 典型周期Fig.4 Cycle of SBR operated at influent acetic acid concentrations of 1500 mg·L-1

2.3 F/F 对嗜盐活性污泥最大PHB 生产能力的影响

为了进一步确定不同F/F 对SBR 富集系统中的生物最大PHB 生产能力的影响，分别取这两个不同F/F 条件筛选阶段末期的嗜盐活性污泥进行PHB 合成能力的测试。

图5（a）、（b）是F/F≤0.33 条件下筛选的菌群在乙酸浓度分别为1500 和3000 mg·L-1时的底物消耗和PHB 合成情况。从图中可以看出，随着进水乙酸浓度的提高，嗜盐体系最大PHB 含量从细胞干重的30%升高到46.7%，乙酸消耗和PHB 积累同时进行。当乙酸完全耗尽后，PHB 的积累达到最大值。在水力停留时间（HRT）为8 h 的发酵周期内，进水乙酸浓度为3000 mg·L-1时可以实现该系统最大的PHB 生产。研究结果表明最大PHB 生产能力与HRT 和进水底物浓度有关，暗示F/F≤0.33 条件下筛选的菌群中PHB 积累菌群是优势菌，具有较好的PHB 积累能力。

图5（c）、（d）表示F/F≥1 条件下筛选的嗜盐污泥在进水乙酸浓度分别为644 和3000 mg·L-1时的底物消耗和PHB 合成情况。在筛选中使用了1500 mg·L-1的进水乙酸浓度，从图4可以看出，在进水乙酸浓度为1500 mg·L-1时系统盛宴期PHB的净增长量为2.65%。进一步降低进水乙酸浓度为644 mg·L-1，在发酵的前1 h 内细胞内PHB 含量出现小幅增长，净增长量不超过细胞干重的1.2%[图5(c)]。但是，这样的小幅增长和系统中乙酸的耗尽达到了同步。在随后的7 h 里，细胞内PHB被逐渐消耗。进一步提高进水乙酸浓度至3000 mg·L-1，在8 h 的发酵周期内剩余乙酸894.2 mg·L-1[图5(d)]。在8 h 的盛宴期内，该系统的PHB含量从10.2%增长至16.3%。

对比3 个进水浓度下PHB 含量的变化可以看出，系统的PHB 含量几乎同进水有机酸的量无关。研究结果表明，F/F≥1 条件下的富集嗜盐系统中，PHB 合成菌的数量较少，系统在该条件下未富集，得到高聚PHB 嗜盐污泥。

2.4 不同F/F 下筛选污泥的PHB 合成表观动力学分析

图5 两个F/F 条件下筛选得到的嗜盐活性污泥分别在不同进水乙酸浓度下的PHB 生产能力Fig.5 PHB production capability of two enriched culture fed with different influent substrate concentrations

表2 不同进水底物浓度条件下的表观动力学参数Table 2 Parameters of observed kinetics under different influent substrate concentration

SBR 中盛宴期的长短直接取决于底物消耗速率，即取决于进水底物浓度、活性生物量浓度和比底物吸收速率[16]。表2对比了不同F/F 下PHB 在不同进水乙酸浓度下的积累动力学参数。在F/F≤0.33条件下选择的嗜盐污泥中，YPHB/S和qP、YX/S和qX随进水乙酸浓度升高逐渐下降，说明高的乙酸浓度降低了PHB 的产率和比合成速率以及细胞产率和增殖速率。这是由于高的外源底物可能提高了细胞的维持能，导致有机物消耗增加。但是，在3 个进水有机物浓度下YX/S始终小于YPHB/S，说明在该系统中有机物的消耗主要用于PHB 的储存。而在F/F≥1 条件下的富集系统中，YPHB/S和qP随进水乙酸浓度升高逐渐升高，而YX/S和qX随进水乙酸浓度升高逐渐降低，说明高的乙酸浓度刺激了PHB 的产率和比合成速率。但是，在3 个进水有机物浓度下YX/S始终大于YPHB/S，说明在该系统中有机物的消耗主要用于微生物的增殖而非PHB 的合成。而且F/F≥1 条件下的富集系统中YPHB/S仅为F/F≤0.33系统的1/10。由此可见，提高F/F，筛选菌群的PHB合成能力迅速降低，系统内的微生物氧化外源有机物用于细胞生长和维持，PHB 积累能力几乎消失。

Albuquerque 等[16]研究了淡水混合菌利用糖蜜合成PHB，在不同进水底物浓度（30，45，60 Cmmol VFA·L-1）（注：Cmmol 即碳毫摩尔，是将物质中的碳为准计物质的量，此处即计VFA 中C 的量）下的菌群选择。其结果表明：在进水底物浓度为45 Cmmol VFA·L-1（F/F=0.21）时，PHB 获得最大产量；在进水底物浓度为60 Cmmol VFA·L-1时，系统严重不稳定，导致F/F 比在0.53～1.1 之间波动，PHB 储存量降低。这一结论支持本研究的结论。F/F对菌群积累PHB 能力的影响是基于对高聚PHB 积累菌群的筛选和富集。长时间的饥饿期能达到限制污泥内部代谢的条件。这样的动态循环的条件给予具有积累PHB 能力的菌群很大的竞争优势，从而使其成为优势种属。在外界碳源过剩的条件下活性污泥更倾向于进行细胞增长而非合成PHB，造成PHB储存能力的降低。本研究中，当进水乙酸浓度由644 mg·L-1升高到1500 mg·L-1后，系统内F/F由原来的0.33 增大到1 以上，导致系统内饥饿期过短，减弱了对PHB 合成菌的选择压。由于没有竞争优势，在高的F/F 下非PHB 积累菌群成为优势菌。

3 结 论

嗜盐活性污泥生产PHB 具有较强的成本优势。本研究接种入海口底泥发展嗜盐活性污泥，利用嗜盐活性污泥以两步法生产PHB。在连续300 d 的试验中探索了不同F/F 筛选菌群的PHB 积累能力。研究结果表明F/F 作为重要的参数直接影响嗜盐活性污泥的PHB 积累能力。F/F≤0.33 条件下筛选的嗜盐活性污泥最大PHB 含量可以达到细胞干重的46.7%以上，PHB 产率为0.358 mg PHB·(mg Ac)-1，该条件下有机物的消耗主要用于PHB 合成；而F/F≥1 条件下筛选的嗜盐系统中最大PHB 含量可以达到细胞干重的16.3%，PHB 产率为0.0549 mg PHB·(mg Ac)-1，该条件下有机物的消耗主要用于微生物的增殖。F/F 作为一种有效的选择压可能对嗜盐污泥种群中的PHB 积累菌群具有重要的选择作用。在高的F/F 下非PHB 积累菌群成为优势菌，而低F/F 促进高聚PHB 嗜盐菌的选择和富集。研究的结果可对进一步实现嗜盐污泥生产PHB 提供有益的指导。

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