百色市某医院白假丝酵母菌基因分型与耐药相关性分析

陈文成+农乐根+覃羽华

【摘要】目的分析当地常见的白假丝酵母菌基因型及其耐药性。方法收集2011年1月～2013年1月右江民族医学院附属医院190株白假丝酵母菌菌株，应用PCR技术对其25SrDNA中的transposable intron基因进行基因型分析。应用MicroScan全自动细菌鉴定仪，对标本分离出的白假丝酵母菌进行鉴定和药物敏感试验。结果感染的190株白假丝酵母菌大多数为A型，共112株（58.95%）；A型对5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率高于B型和C型；A、B、C三型对氟康唑全部耐药，而对两性霉素均敏感。结论不同基因型的白假丝酵母菌对药物的敏感性不同，应针对不同基因型别的白假丝酵母菌应用不同的药物进行治疗。

【关键词】白假丝酵母菌；基因分型；耐药性

中图分类号：R34 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.03.003

Analysis of correlation of genotyping and drug resistance

of candida albicans in a hospital in Baise

CHEN Wencheng，NONG Legen，QIN Yuhua▲

（Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveTo analyze genotyping and drug resistance of candida albicans which is normally seen in the local region.MethodsA total of 190 strains of candida albicans were collected from Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities from January，2011 to January，2013.Transposable intron gene in 25SrDNA were analyzed by polymerase chain reaction （PCR），identification of candida albicans which was isolated from the specimen and its drug sensitivity test were performed by MicroScan automatic bacterial identification instrument.Results Majority of the 190 infected candida albicans were type A，with a total number of 112 strains（58.95%）.Drug resistance rate of genotype A to 5fluorocytosine，itraconazole and voriconazole was significantly higher than those of genotype B and genotype C.Genotype A，genotype B and genotype C were all resistant to fluconazole，but sensitive to amphotericin.ConclusionDifferent genotypes of candida albicans has different sensitivity to drugs.Thus，different genotypes of candida albicans should be treated by different drugs.

【Key words】candida albicans；genotype；drug resistance

白假丝酵母菌（Candida albicans）是人体内常见的条件致病真菌，近年来，由于滥用广谱抗生素、大量使用免疫抑制剂以及广泛运用侵入性技术等原因，导致白假丝酵母菌的感染率显著增加。白假丝酵母菌感染的特征之一就是存在地区差异，不同地区引起感染的白假丝酵母菌的类型不一样[1]，因此，研究不同地区白假丝酵母菌的基因型和耐药性有十分重要的意义。本研究应用PCR技术和常规的药敏试验对分离的190株白假丝酵母菌菌株中的25SrDNA进行基因型和耐药性分析，为临床诊断和治疗提供有利的依据。

1材料与方法1.1菌株 收集2011年1月～2013年1月右江民族医学院附属医院190株白假丝酵母菌菌株，分别来源于男性151例，女性39例，年龄≥45岁。菌株主要来自痰标本（80.64%），其余为咽拭子、尿液、血液、伤口分泌物、大便、穿刺液等标本。所有白假丝酵母菌均经革兰氏染色镜检确认，用MicroScan全自动微生物分析系统进行鉴定。标准菌株：白假丝酵母菌ATCC90028。

1.2培养基血平板、中国兰培养基、CHROMagar培养基。

1.3PCR试剂Taq PCR MasterMix 购自北京天根生化科技有限公司。PCR仪为美国BioRad基因扩增仪。引物：25SrDNA引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R（5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3），由华大中生科技有限公司合成。endprint

1.4方法

1.4.1细菌培养及鉴定应用MicroScan全自动细菌鉴定仪，选择细菌鉴定与微量MIC复合板进行微生物鉴定和药物敏感试验。结果按NCCLS标准（2010版）判定。采集患者的咽拭子、痰、气管冲洗物、血液、浓液、粪便等标本，接种于血平板、中国兰培养基、CHROMagar培养基进行分离培养，用糖发酵（葡萄糖、乳糖、麦芽蓎、甘糖、蔗糖、纤维双糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖、海藻糖）实验、革兰染色及血清学实验进行菌种鉴定。接种沙保培养基4℃保存，转种马铃薯培养基37℃48～72小时备用。

1.4.2药敏试验 白假丝酵母菌药敏试验选用临床常用的抗真菌药物（5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、两性霉素、伊曲康唑）进行敏感性试验。

1.4.3提取白假丝酵母菌DNA用酚氯仿抽提法提取白假丝酵母菌DNA，取2～3种马铃薯培养基白假丝酵母菌溶解于200 μL E 液，加入250 μL GPT试剂，离心12 000转5分钟，加入等体积的100%异戊醇和1/10醋酸钠溶液-20℃放置1小时，离心12 000转20分钟，用70%冰酒精脱水，无菌TE 液溶解备用。

1.4.4基因分析应用PCR技术对其25SrDNA中的transposable intron基因进行基因型分析，通过其扩增的片段大小，将白假丝酵母菌分成三组：A组（片段大小约450 bp）、B组（840 bp）、C组（450 bp和840 bp）；引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R （5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3）。在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳后，在紫外光透射仪上观察，摄片并记录结果。

1.5结果判定根据PCR扩增产物的大小和条带数目确定基因型，一条450 bp带为A型，一条840 bp带为B型，一条450 bp带和一条840 bp带为C型。

1.6数据统计记录白假丝酵母菌的基因分型结果和药敏试验结果并分析其相关性。

2结果2.1基因分型结果190株白假丝酵母菌菌株的基因分型根据电泳图谱分为A、B、C三型（见图1），其中A型112株（58.95%），B型58株（30.53%），C型20株（10.53%）。

2.2药敏试验结果不同基因型白假丝酵母菌的药敏试验结果见表1。

图1 白假丝酵母菌基因分型结果。

表1不同基因型白假丝酵母菌药敏结果（%）

药物A型（112株）SIRB型（58株）SIRC型（20株）SIR5氟胞嘧啶84.2105.71000010000氟康唑001000010000100伏立康唑84.2015.292.61.16.193.36.70两性霉素94.75.201000010000伊曲康唑26.32152.684.25.310.575.66.717.8注：S表示敏感；I表示中介；R表示耐药。

2.3基因型与药敏相关性分析本实验显示本地感染的白假丝酵母菌大多数为A型，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、两性霉素、伊曲康唑5种常见的抗真菌药中，A型对5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率高于B型和C型；A、B、C三型对氟康唑全部耐药，而对两性霉素均敏感。

3讨论白假丝酵母菌是人体内常见的条件致病真菌，也是最常见的引起深部感染的真菌，越来越受到医学界的重视[2～4]。全球不同地区、不同人种中，白假丝酵母菌感染的流行病学特征不同；不同地区引起感染的白假丝酵母菌的类型不一样，由于类型不同，其引起感染的症状、对药物的敏感性及流行病学特征均不同。研究表明，许多院内白假丝酵母菌感染是由内源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽视的问题[5，6]。因此，研究当地的白假丝酵母菌感染的基因类型和药物敏感性将有助于了解该地区医院院内白假丝酵母菌感染的临床特点、菌种分布特征及诱发该菌感染的危险因素，有助于真菌标本的快速检验和鉴定，有助于真菌感染性疾病的早期诊断、早期治疗[7～9]。并且可以和其他地区的相关资料进行比对，对预防和治疗白假丝酵母菌感染，提高对医院内感染的认识均有重要意义。本研究应用PCR技术和常规的药敏试验对从本院患者分离的白假丝酵母菌菌株中的25SrDNA进行基因型和耐药性分析。研究结果显示：190株白假丝酵母菌菌株中，A型占了大多数（58.95%），C型比较少见，未检出D型和E型。不同基因型白假丝酵母菌的药敏试验结果显示，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、两性霉素、伊曲康唑5种常见的抗真菌药中，A型对5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐药率高于B型和C型；A、B、C三型对氟康唑全部耐药，而对两性霉素均敏感。

本实验所用190株白假丝酵母菌菌株全部分离自我院住院患者，年龄≥45岁，主要以肺部感染疾病为主，并伴有一种或多种基础疾病，菌株主要来源于痰标本，均有长期大量使用抗生素的病史。研究表明，长期大剂量接受抗生素治疗使自身正常菌群受到破坏，机体免疫功能减弱，给真菌的感染创造了良好的条件[10]。了解我院不同基因型别的白假丝酵母菌的分布及耐药情况，将有助于发现易感菌株，对医院感染源的追踪和研究真菌感染情况，指导临床用药有重要的意义，对白假丝酵母菌的流行病学的研究有重要价值。参考文献[1] Myoung Y，Shin JH，Lee JS，et al.Multilocus sequence typing for Candida albicans isolates from candidemic patients：comparison with southern blot hybridization and pulsedfield gel electrophoresis analysis[J].Korean J Lab Med，2011，31（2）：107114.endprint

[2] Staniszewska M，Bondaryk M，Malewski T，et al.Quantitative expression of Candida albicans aspartyl proteinase genes SAP7，SAP8，SAP9，SAP10 in human serum in vitro[J].Pol J Microbiol，2014，63（1）：1520.

[3] 吉地阿依，丁显平. 老年患者白假丝酵母菌基因分型与药敏试验分析[J].成都医学院学报，2013，8（4）：417419.

[4] 彭奕冰，季育华，倪语星，等.白假丝酵母临床分离株基因分型与药敏分析[J].检验医学，2006，21（1）：2224.

[5] 赵国章. 脓液培养阳性245例结果及耐药性分析[J].右江医学，2011，39（6）：735736.

[6] 郭雅莉，李春莉，刘原君，等.白念珠菌多位点序列分型研究[J].中国皮肤性病学杂志，2012，26（ 3） ： 213216.

[7] Shahana S，Childers DS，Ballou ER，et al.New Clox Systems for rapid and efficient gene disruption in Candida albicans[J].PLoS One， 2014，9（6）：e100390.

[8] Takakura S，Ichiyama S，Bain JM，et al.Comparison of Candida albicans strain types among isolates from three countries[J].Int J Med Microbiol，2008，298（78）：663668.

[9] Lott TJ，Frade JP，Lockhart SR.Multilocus sequence type analysis reveals both clonality and recombination in populations of Candida glabrata bloodstream isolates from US surveillance studies[J].Eukaryot Cell，2010，9（4）：619625.

[10] Lévesque S，Michaud S，Arbeit RD，et al.Highresolution melting system to perform multilocus sequence typing of Candida glabrata[J].PLoS One，2011，6（1）：e16167.

（收稿日期：2015-03-31修回日期：2015-06-13）

（编辑：潘明志）endprint