山东汉族TIM-1基因多态性与2型糖尿病肾脏病的相关性

李美晔，姜兆顺，曲　卫，赵宝昌

临床医学

山东汉族TIM-1基因多态性与2型糖尿病肾脏病的相关性

李美晔，姜兆顺，曲卫，赵宝昌＊

［摘要］目的探讨T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1（TIM-1）基因多态性与山东汉族2型糖尿病肾病的相关性。方法采用病例-对照的方法，收集2型糖尿病肾病患者112例，正常对照组201例。采用改良的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测TIM-1基因的两个SNP位点：rs1039438和rs6878732，计算其基因型频率及等位基因频率并统计分析。结果rs1039438位点的基因型频率与等位基因频率在对照组和2型糖尿病肾病组中有显著的统计学差异 （P值分别为0.005和0.002），rs6878732位点的基因型频率与等位基因频率在两组间无统计学差异。结论TIM-1基因与山东汉族人群2型糖尿病肾病的发病有明显相关性，rs1039438位点的G等位基因可以增加2型糖尿病肾病发病风险，而此位点的A等位基因则为保护因素。

［关键词］T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1；糖尿病肾病；基因多态性；病例-对照研究；改良型PCRRFLP

近几十年来，随着我国糖尿病的发病率逐步升高，糖尿病的慢性并发症也逐渐成为危害人类健康的重要病因。其中，糖尿病肾脏病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾衰竭的常见原因。DKD的发病机制截至目前尚未完全明确，可能与高血糖导致的代谢紊乱、肾小球血流动力学改变及遗传易感性等多种因素有关［1］。近年来研究表明，DKD的发病与T淋巴细胞的激活及细胞因子诱导的炎症反应有关［2］。T淋巴细胞的激活取决于Th1/Th2细胞的平衡状态，而T细胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，TIM-1）选择性表达于激活的CD4+T细胞表面，并持续地优先表达于Th2细胞［3］。人类TIM-1基因的启动子区与编码区存在多态性变换，其基因多态性可能与包括过敏性鼻炎、哮喘、类风湿性关节炎在内的多种疾病存在相关性［4］。但目前尚未有文献报道TIM-1基因多态性是否与DKD相关，为此，笔者应用改良型聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，检测了山东汉族人群2型糖尿病DKD患者的TIM-1基因rs1039438和rs6878732两个SNP位点，探讨基因型与疾病之间的联系，为了解糖尿病肾病的遗传易感性及发病机制提供实验依据。

1　研究对象

1.1DKD组2014年5月—2015年4月，于笔者所在医院住院并诊断为DKD的患者112例。男58例，女54例；年龄（59.61±10.18）岁；平均病程（8.9±4.1）年。均符合2014年《糖尿病肾病防治专家共识》的诊断标准及分型标准。经知情同意后纳入研究。

1.2正常对照（NC）组选取同期于笔者所在医院查体中心健康体检者201例。男107例，女94例；年龄（54.52±12.07）岁。排除了糖尿病、高血压和肾原发性及继发性相关疾病。以上全部研究对象均为山东汉族人群。

2　研究方法

2.1引物设计与合成在Hapmap网站，选取TIM-1基因的两个tag SNP：rs1039438和rs6878732。根据SNP位点编号，在Ensemble网站查找相关序列。然后用Primer Premier5软件设计引物如下：①用于特异性扩增rs1039438多态位点的上游引物为：5'-TTGCCCAATGTCAGCCTTGGTAATGATTTACA ACCCTTAA-3'，在此上游引物的倒数第三位碱基由A突变为T，引入AflⅡ酶切位点，下游引物为：5'-GGGGAATGTAGCCCTATGCTGGAGAA-3'。②用于特异性扩增rs6878732多态位点的上游引物为：5'-AAGATTCTGTCTCTATCTAAATAA-3'，下游引物为：5'-TATTCCAGGAGGTGATGATCTCTTGTGA TAGGCACCAGGAG-3'，在此下游引物的倒数第三位碱基由A错配为G，引入HinfⅠ酶切位点。设计的引物由上海生工生物工程公司合成。

2.2外周血基因组DNA的提取常规抽取静脉血，取100 μl全血经大连宝生物工程有限公司（Takara）的“Blood Genome DNA Extracction Kit”试剂盒提取基因组DNA。

2.3PCR扩增反应条件为：95℃预变性5 min；35个循环 （94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s），72℃反应10 min。取扩增产物5 μl及适量Marker，经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察片段大小是否为靶片段。

2.4限制性内切酶酶切取rs1039438和rs6878732 的PCR产物各10μl，分别加入限制性内切酶AflⅡ和HinfⅠ各2 U，10×buffer 2μl，以灭菌水补足反应体积至20μl，于37℃孵育3h。终止反应后，各取酶切产物10 μl及适量Marker经2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后在紫外灯下观察、摄像，记录并计数基因型。

2.5统计学分析用SPSS 17.0软件包分析处理数据。直接计算两个位点的基因型频率和基因频率，用Hardy-weinberg平衡公式检验群体代表性。以±s表示计量资料，用方差分析比较组间差异。以α=0.05为检验标准，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结　果

3.1TIM-1基因SNP位点基因型分析

3.1.1TIM-1基因rs1039438 SNP位点PCR扩增产物片段大小为193 bp，酶切产物获得三种基因型：①纯合子AA基因型，仅有193 bp 1个片段；②纯合子GG基因型：有153 bp+40 bp 2个片段；③杂合子GA基因型，有193 bp+153 bp+40 bp 3个产物片段。见图1。

1泳道为Marker，2～10泳道为样品的检测结果图1　rs1039438 SNP位点AflⅡ酶切后电泳结果

3.1.2TIM-1基因rs6878732 SNP位点PCR扩增产物片段大小为152 bp，酶切产物获得三种基因型：①纯合子TT基因型，仅有152 bp 1个片段；②纯合子AA基因型，有153 bp+40 bp 2个片段；③杂合子TA基因型，有193 bp+153 bp+40 bp 3个片段。见图2。

1泳道为Marker，2～7泳道为样品的检测结果图2　rs6878732 SNP位点HinfⅠ酶切后电泳结果

3.2DKD组和正常对照组多态位点基因型频率及等位基因频率经χ2检验，两组人群基因型分布符合Hardy-weinberg平衡，具有群体代表性 （表1）。rs1039438位点的三种基因型GG、GA、AA在对照组的频率分别为0.691、0.284、0.061，在DKD组中的频率分别为0.857、0.125、0.056，两组间比较，P值为0.005，提示其基因型频率在两组间存在显著性差异。其中，等位基因G在DKD组频率显著高于对照组频率（0.919 vs 0.832，P=0.002），提示该等位基因可能为DKD的易感等位基因。等位基因A在DKD中频率显著低于对照组频率（0.081 vs 0.168，P=0.002），提示等位基因A可能为DKD发生的保护因素。rs6878732位点的基因型频率与等位基因频率在两组间均无显著性差异。

表1　TIM-1基因型和等位基因DKD组与对照组频率分布

4　讨论

DKD是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是导致终末期肾衰竭的常见原因。其病理改变包括肾肥大、肾小球与肾小管基底膜增厚及肾小球和肾小管间质细胞外基质进行性积聚。虽然传统观点认为DKD为非免疫系统疾病，但越来越多的研究表明，固有免疫系统的激活和炎症机制在DKD的致病机制中起重要作用［5，6］。

T淋巴细胞是重要的免疫细胞，CD4+T细胞通过调节自身或其他免疫细胞分泌各种细胞因子，这些细胞因子既可以导致胰岛β细胞损伤参与胰岛素抵抗，也可通过各种途径造成肾组织损伤和纤维化，导致DKD的发生。戴勇等［2］利用流式细胞法分析对慢性肾功能不全患者外周血进行研究，发现与正常对照相比，患者体内Th1/Th2比值明显下降，因此，T淋巴细胞介导的免疫异常可能在DKD的发生发展中起重要作用。区分Th1和Th2细胞亚群的重要标志之一是CD4+T细胞上TIM-1基因的选择性表达，CD4+T细胞被抗原激活后，细胞表面开始表达TIM-1基因并向Th2细胞偏移，Th1/Th2失衡可引起多种免疫性疾病。Shirzade等［7］在伊朗人群中，通过对300例哮喘缓和和309例正常对照的病例对照研究发现，TIM-1基因与伊朗人群的哮喘发生有相关性。Kim等［8］发现TIM-1的一个6氨基酸的插入多态（157insMTTTVP）与人类的严重性甲型肝炎感染有关。

TIM-1基因是人类TIM基因家族第一个被识别的成员，在肝和肾中有不同的mRNA转录本，但是编码相同的蛋白质。在TIM-1基因的启动子区域和基因编码区都发现了一些与疾病相关SNP位点，有些SNP位点是功能性的，而有一些则仅作为疾病的遗传标记。本研究得出的结论提示，TIM-1基因多态性中的不同等位基因或与DKD的易感性相关。但是由于病例尚少，所以需要收集更大的样本，同时，需要从TIM-1的功能出发，去阐明TIM-1基因在DKD的发生中起何种作用。

【参考文献】

［1］Zethelius B，Hales CN，Lithell HO，et al.Insulin resistance，impaired early insulin response，and insulin propeptides as predictors of the development of type 2 diabetes：a populationbased，7-year follow-up study in 70-year-old men［J］.Diabetes Care，2004，27（6）：1433-1438.

［2］戴勇，李富荣，李雄根，等.慢性肾功能不全患者外周血Th1/ Th2淋巴细胞平衡的研究［J］.实用医学杂志，2002，18（1）：36-37.

［3］Meyers JH，Sabatos CA，Chakravarti S，et al.The TIM gene family regulates autoimmune and allergic diseases［J］.Trends Mol Med，2005，11（8）：362-369.

［4］Liu Q，Shang L，Li J，et al.A functional polymorphism in the TIM-1 gene is associated with asthma in a Chinese Han population［J］.Int Arch Allergy Immunol，2007，144（3）：197-202.

［5］Navarro-Gonzalez JF，Mora-Femandez C，Muros de Fuentes M，et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Nat Rev Nephrol，2011，7（6）：327-340.

［6］Lin M，Yiu WH，Wu HJ，et al.Toll-like receptor 4 promotes tubular inflammation in diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol 2012，23（1）：86-102.

［7］Shirzade H，Meshkat R，Ganjalikhani-Hakemi M，et al.Association analysis of-416 G Cpolymorphism of T-cell immunoglobulin and mucin domain-1 gene with asthma in Iran［J］.Int J Immunogenet，2015，42（4）：265-269.

［8］Kim HY，Eyheramonho MB，Pichavant M，et al.A polymorphism in TIM1 is associated with susceptibility to severe hepatitis A virus infection in humans［J］.J Clin Invest，2011，121（3）：1111-1118.

［2015-05-18收稿，2015-06-15修回］［本文编辑：王军红］

［中图分类号］R587.1

［文献标志码］A

［作者单位］250031山东济南，济南军区总医院内分泌科（李美晔，姜兆顺，曲卫）；271016山东泰安，泰山医学院遗传学教研室（赵宝昌）

［通讯作者］赵宝昌，Email：306519893@qq.com

AssociationbetweenTIM-1genepolymorphismandtype2diabetickidneydiseaseinaHan population of Shandong Province

LI Mei-ye，JIANG Zhao-shun，QV Wei，et al.Department of Endocrinology，the General Hospital of Jinan Military Command，Jinan，Shandong 250031，China

［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheassociationbetweenTIM-1genepolymorphismandthe susceptibility of type 2 diabetic kidney disease in a Han population of Shandong Province.MethodsIn this case-control study，112 cases of type 2 diabetic kidney disease patients and 201 normal controls were collected. The two SNPs of TIM-1 gene：rs1039438 and rs6878732 in both groups were analyzed.Improved PCR-RFLP by their genotype frequency and allele frequency were calculated and compared.ResultsA significant difference between the DKD and control groups was found in the rs1039438 genotype and allele，no significant difference was found in rs6878732.ConclusionThe rs1039438 SNP polymorphism of TIM-1 gene might be associated with susceptibility of type 2 diabetic kidney disease.allele G could increase the risk of this disease，while allele A might be a protective factor.

［Key words］TIM-1；Diabetic kidney disease；Gene polymorphism；Case-control study；Improved PCR-RFLP