血凝抑制实验中常出现的误差及解决办法

李旭蓉，李 珊

（张掖市动物疫病预防控制中心，甘肃 张掖734000）

近年来，为了加强动物疫情监测工作，及时掌握疫情动态和免疫效果，有效地防止疫情发生和传播。张掖市禽流感春秋两季和日常监测免疫抗体工作量也逐年增加，血凝和血凝抑制试验是目前实验室检测禽流感中最常用的方法，此方法在实验中虽然操作简单，判定结果方便，却很容易因为操用不规范，技术不正确而影响试验结果的准确性。笔者对影响试验结果准确性的因素进行了简单分析讨论，以供同行参考。

1 抗原的标定

禽流感血凝抑制试验中必须对抗原进行标定，这是非常重要的环节。通常所用的抗原为H5亚型（Re-4或Re-6株）抗原，同一批号的抗原同时标定两瓶以上，最好用110°V 型板进行标定，重复做几板，以防每板4排结果的准确性和一致性，以减少误差。HA 标定滴度过高或过低都会HI结果。过高，HI滴度偏低；过低，HI滴度偏高，甚至很高。配成4HAU 抗原后，为防止抗原配制不准确，可作抗原回归试验，若有2孔凝集，则视为抗原配制准确，如果抗原回归试验不成立，则需要调整4HAU 抗原的浓度，至抗原回归试验成立为止。

2 红细胞的配制

由于鸡的个体差异，红细胞对病毒的敏感性也不同从而影响HI效价，一般需要3 只以上非免疫公鸡提供的红细胞混合在一起，可以减少自凝现象的干扰。有抗体鸡提供的红细胞需要多洗涤几次，以减少血液中抗体对试验结果的影响。洗涤时要去除表面的白细胞膜，洗好的红细胞浓度应在0.5%～1%间最为合适，经过多次实践0.75%比较合适，浓度为1%时沉降的血点过大，浓度为0.5%时，沉降的血点太小，不易判断，而且沉降速度慢。过高或过低都会影响HI滴度的准确测定。有的鸡红血球沉降慢，静置30 min 仍不能沉降下来。因此，配制好的红细胞，一定要先观察血沉质量，不合格的不能使用。

3 稀释液（PBS）的配制

稀释液的pH 为7.0～7.2时红细胞沉淀最充分，图形也最清晰。稀释液的pH 在5.8以下，红细胞易自凝；pH 为7.8 以上凝集的红细胞易洗脱加快。pH7.2的稀释液要121 ℃灭菌15min后4 ℃保存备用，配制好稀释液时间不易过长，否则，会污染，出现试验不成立或跳孔等现象。如果用生理盐水代替PBS液，最好使用新开瓶的灭菌生理盐水，配制稀释液时要注意结晶水的问题。

4 时间和温度

时间温度对实验结果也有影响，要求室内温度在20～25℃进行实验，室内温度不适宜的应置于恒温箱内。因为温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象，且反应速度慢，高于37℃时，凝集的红细胞易洗脱，红细胞沉降很快，导致试验不成立，抗原与抗体作用时间应在规定的时间及时观察，过短出现凝集不完全。过长出现洗脱现象，超过10 min，红细胞发生裂解，结果不再有意义。

5 血清稀释的混合程度

稀释血清时，如果混合不均匀，结果会出现差异，因此稀释时要来回吹打10次以上。在稀释前先要按下移液器再插入反应板的每一孔孔底，来回吹打时手不要完全按下放开，在一个小的范围内吹打，最后慢慢放开手吸取后插入第二孔液面以下，这样孔内和吸头内不易产生气泡，且稀释充分。在反复抽取过程中，移液器吸头不要离开液面，防止产生气泡和液体溅出孔面，造成移液体积不准确。影响检测结果的准确性。另外，连续加样时要用倒吸法。

6 V 型微量反应板

反应板的质量和清洁度对凝集反应有着不可忽视的影响，必须使用反应板透明度好及凹孔干净，孔内壁光滑透明，板面水平，不能弯曲、倾斜。试验中应采用90°V 型或者110°V 型微量反应板，如用不同角度V 型微量反应板混用和陈旧反应板，对实验结果的准确性也产生一定的影响。

7 HI的判定方法

试验时要做红细胞对照、阳性血清对照和阴性血清对照。一般来说，阳性血清对照的时间相对长些，在红血球完全沉降的前后5min内判定试验结果较好，判断结果时，将微量反应板倾斜45度，孔底沉定的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集抑制。

总之在进行禽流感血凝抑制试验时应综合考虑各方面因素，制定一个标准化操作方法以免对结果判断产生误差，只有把试验标准化才能正确评价疫苗免疫存在的意义。也只有在标准化评判过程中才能做出正确的结论。