尼古丁对重度急性胰腺炎保护作用的研究＊

崔广宾，李晓武，苗建军，王 金，王桂岭，尚培中△

（1.河北北方学院研究生院，河北张家口 075000；2.中国人民解放军第251医院普通外科，河北张家口 075000）

编者按：尼古丁不仅仅存在于烟叶之中，也存在于多种茄科植物的果实之中，随着科学的不断进步，人们认识到尼古丁并不是香烟致癌的罪魁祸首，微量的尼古丁并不直接对人体造成危害。目前已有临床研究证明，尼古丁有望成为治疗老年痴呆症、帕金森症、抑郁症的有效药物。

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是指多种病因引起的胰酶激活，继以胰腺局部炎性反应为主要特征，伴或不伴有其他器官功能改变的疾病［1］。轻度急性胰腺炎（MAP）大多数患者的病程呈自限性，而重度急性胰腺炎（SAP）起病急、病势凶险，短期内即可引起组织器官氧化损伤、级联瀑布式炎性反应，最终导致多器官功能障碍综合征（MODS），病死率高达36%～50%［2］。近年的研究表明，炎症细胞、细胞因子和炎症介质在SAP的发生、发展中起着重要作用［3］。最近的一项研究表明，树突状细胞（DCs）是AP中胰腺存活必不可少的细胞，可以保护器官免受细胞应激的影响［4］。DCs是体内功能最强的抗原提呈细胞（APC），作为适应性免疫应答的启动者，在机体抗炎反应中发挥重要作用。DCs的成熟状态对其发挥免疫效应起到了至关重要的作用。尼古丁又名烟碱，是烟草中含氮生物碱的主要成分。在一项关于尼古丁减轻急性肺损伤的研究中，实验人员证实了尼古丁的抗炎作用［5］。本研究通过建立SAP模型，观察经过尼古丁的处理后，SAP小鼠脾脏中DCs以及血清中IL－6、IL－10、TNF－α水平的变化程度以及对SAP小鼠病死率的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性清洁级BALB／c小鼠100只，体质量（20±1）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，常规喂养，实验前12h禁食，自由饮水；尼古丁、L－精氨酸购自美国Sigma公司。实验时用0.9%的生理盐水将尼古丁配成不同剂量（0.1、0.2、0.3mg／kg）的溶液；胶原酶D（美国Sigma公司），小鼠淋巴细胞分离液（北京昊成天翔商贸有限公司），RPMI 1640培养液与热灭活胎牛血清（北京思塞因科技有限公司），DC阴选试剂盒（美国BD公司），小鼠抗DC（CD11c微磁珠），DC表面单克隆荧光抗体Fc阻断剂——纯化大鼠抗小鼠CD16／CD32（FcγⅢ／Ⅱ－R）抗体、抗 CD11c单克隆抗体－别藻蓝蛋白（CD11c－APC）、抗CD45RB单克隆抗体－藻红蛋白（CD45RB－PE）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗小鼠CD40、CD80、CD86、I－a／e（美国BD Biosciences Pharmingen公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及实验分组 参照文献［6］方法建立小鼠SAP模型，分2次腹腔注射8%L－精氨酸（40mg／kg），间隔1h，对照组按同样方法注射0.5mL生理盐水。按照随机分配原则将动物分为对照组、SAP组、尼古丁干预组（0.1、0.2、0.3 mg／kg），各组再随机分成0、12、24、48、96h等5个亚组，每个亚组4只小鼠。

1.2.2 标本采集与处理 分别在每个时间点摘除眼球取血0.5～1.0mL，离心后留血清－20℃下保存待测。之后，固定小鼠于仰卧位，沿腹中线依次切开皮肤、腹壁各层进入腹腔，暴露脾脏，钝性取被膜脾脏，置入盛有PBS液的平皿中用于提取DCs。因L－精氨酸引起的胰腺炎模型，胰腺组织改变是均一性的，因此随机选取胰腺组织浸泡于4%多聚甲醛用于病理检测。

1.2.3 小鼠脾细胞的分离及单个核细胞的制备 留取脾脏，剪碎组织，用研磨棒于220目金属网上研磨。将细胞悬液贴15.0mL离心管壁小心加入到小鼠淋巴细胞分离液上，20℃、1500r／min离心15min，吸取中层絮状物，置于离心管中，加4倍D－PBS缓冲液重悬，4℃、1000r／min离心10min，去除多余的淋巴细胞分离液，所得细胞即为小鼠脾脏单个核细胞。

1.2.4 磁珠孵育和磁性分选脾脏CD11clowCD45RBhighDCs使用DCs阴选试剂盒分选获得DCs，具体操作严格按说明书进行。富集的小鼠脾脏DCs不含抗体及磁珠，细胞计数后用于后续实验。CD11clowCD45RBhighDCs的纯化通过抗CD11c磁珠选出。

1.2.5 荧光抗体染色 将1.2.4中的CD11clowCD45RBhighDCs孵育24h，连同孵育液一并加入流式管，离心，吸取上清，－70℃保存。加入100μL PBS重悬离心后沉淀的细胞，调整细胞密度为2×105个／mL，加入Fc阻断剂1μL，4℃孵育15 min；分 别 加 入 5μL CD11c－APC、CD45RB－PE、CD40－FITC、CD80－FITC、CD86－FITC、I－a／e－FITC，避光孵育15min；加入2 mL PBS洗涤1次，离心后去上清，加入0.4mL PBS，采用流式细胞仪检测相关标记物。

1.2.6 血清中细胞因子水平的检检测 所有全血立即37℃恒温孵育15min，3000r／min离心10min，分离血清，按照ELISA试剂盒说明书检测IL－10、IL－6及TNF－α的表达水平，每组设3个复孔。

1.2.7 观察尼古丁对SAP小鼠病死率的影响 取60只小鼠，分成5组，每组12只，按照1.2.1中分组方法，分别观察在0、12、24、48、96h小鼠死亡数量，最长持续到第8天。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件处理数据，计量资料以表示，两组间均数比较采用t检验。检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠脾脏DCs分离与亚群鉴定 用标染的CD11c－APC和CD45RB－PE对分选所得的DCs同时进行染色，染色满意后采用流式细胞仪进行分析，结果显示所得DCs分为3群，即CD11clowCD45RBhighDCs、CD11chighCD45RBlowDCs和CD11clowCD45RBlowDCs。采用磁珠分选技术获取CD11clowCD45RBhighDCs，流式细胞术检测存活率大于90%。见图1。

图1 细胞亚群流式细胞图

2.2 尼古丁刺激后小鼠脾脏中DCs亚群分化的比例变化与SAP组比较，12h时尼古丁干预组R1数量变化不显著，R2数量显著增加，而在24、96h，尼古丁干预组的R1数量较SAP组降低，在24、48、96h时，R2数量显著增加。见表1。

表1 尼古丁刺激后小鼠脾脏中DCs亚群分化的比例（，%）

表1 尼古丁刺激后小鼠脾脏中DCs亚群分化的比例（，%）

a：P＜0.05，与SAP组比较。

区域尼古丁组R1 36±2 36±3 40±4 34±2a 12h SAP组 0.3mg／kg尼古丁组24h SAP组 0.3mg／kg尼古丁组48h SAP组 0.3mg／kg尼古丁组96h SAP组 0.3mg／kg 33±2 30±3 30±2 28±3 R2 14±4 18±1a 12±3 20±2a 15±4 25±2a 17±2 34±3a

表2 各组血清中IL－10水平的变化（，pg／mL）

表2 各组血清中IL－10水平的变化（，pg／mL）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与 SAP组比较，c：P＜0.05，与0.1mg／kg组比较。

组别4±2 5±2 4±3 7±1 6±3 SAP组 159±28a108±21a99±27a175±19a121±23a尼古丁组0.1mg／kg 151±24b 111±19119±24b 196±28b 132±19b 0.2mg／kg 139±31b 129±29bc 136±21bc 239±34bc 120±24c 0.3mg／kg 161±31c 135±17bc 155±25b＃ 269±21bc 195±190h 12h 24h 48h 96h对照组bc

2.3 尼古丁刺激后SAP小鼠血清中细胞因子的变化 SAP小鼠血清中L－10、TNF－α与IL－6水平较对照组小鼠明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；经尼古丁刺激后，血清中TNF－α与IL－6水平较SAP组小鼠明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL－10水平明显升高，并且呈现剂量依赖效应（P＜0.05）。见表2～4。

表3 各组血清中TNF－α水平的变化（，pg／mL）

表3 各组血清中TNF－α水平的变化（，pg／mL）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与 SAP组比较；c：P＜0.05，与0.1mg／kg比较。

组别9±4 8±3 10±5 9±2 8±5 SAP组 25±2a408±21a399±27a175±19a121±23a尼古丁组0.1mg／kg 29±4374±28b 371±12b 207±10b 99±24b 0.2mg／kg 27±5415±17327±19bc 161±19bc 109±31b 0.3mg／kg 24±3289±17bc 295±25bc 109±21bc 55±190h 12h 24h 48h 96h对照组bc

2.4 尼古丁降低SAP小鼠病死率 为了验证尼古丁可以改善SAP小鼠的病死率，本研究观察了尼古丁干预后SAP小鼠病死率的变化。如图2所示，与未注射尼古丁的小鼠相比，0.1 mg／kg尼古丁干预模型小鼠的病死率略有下降。而0.3mg／kg尼古丁干预显著降低SAP小鼠病死率（P＜0.05），而0.1 mg／kg和0.2mg／kg尼古丁的保护作用表现却不明显（P＞0.05）。

表4 各组血清中IL－6水平的变化（，pg／mL）

表4 各组血清中IL－6水平的变化（，pg／mL）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与SAP组比较；c：P＜0.05，与0.1mg／kg比较。

组别26±4 31±3 27±3 25±2 31±4 SAP组 29±3108±21a199±27a175±19a121±23a尼古丁组0.1mg／kg 26±694±17b 160±20b 160±23b 111±16b 0.2mg／kg 31±5101±22b 139±27bc 151±18bc 109±23bc 0.3mg／kg 27±389±17bc 145±25bc 109±21bc 95±190h 12h 24h 48h 96h对照组bc

图2 尼古丁降低SAP小鼠病死率

3 讨 论

SAP是临床一种常见的急危重症，单纯的支持疗法或者手术治疗并未能显著降低器官损害的发生率以及SAP病死率。SAP治疗经历了一些重要变革，包括早期液体复苏、预防性抗菌药物应用、血液滤过等部分治疗手段，但是从总体治疗的效果来看，治疗手段日新月异并没有带来临床结局的显著改善［6］。胰腺炎是一种炎症性疾病，炎性反应是SAP早期重要的病理变化，过度的炎性反应引起的炎症反应综合征的发生是导致器官损伤甚至SAP早期死亡的主要原因。因此，有效调节早期超强的炎性反应及控制后期感染和内毒素血症的发生是治疗SAP的关键。

CD11clowCD45RBhighDCs是由Groux等［7］于1999年从IL－10转基因小鼠和正常BalB／c、C57BL／6小鼠的脾脏内分离出的一个DCs的亚群。该群细胞存在于正常小鼠的脾脏及淋巴结内，特别在IL－10转基因的小鼠中。CD11clowCD45RBhighDCs通过分泌IL－10抑制机体的炎性反应，本研究也同样发现了这一现象。

近年来的研究证实胆碱能抗炎症通路（CAP）是一种神经－免疫调节通路，迷走神经及其递质乙酰胆碱（Ach）与免疫细胞上烟碱型胆碱能受体（nAchR）结合，通过细胞内信号传导途径抑制炎性因子的释放，从而防止炎性过度反应。尼古丁作为nAchR的激动剂，具有的抗炎作用引起了作者的重视。本研究发现，经过尼古丁干预后SAP小鼠体内的CD11clowCD45RBhighDCs明显增加，同时，血清中IL－10水平显著升高，IL－6和TNF－α的水平明显降低。更为重要的是，经过尼古丁的干预明显增加了SAP的存活率，对SAP表现出保护作用。有研究人员在脓毒症模型中也发现了同样的现象，尼古丁可以抑制促炎因子的释放，提高脓毒症大鼠的存活率［8］。而与Aicher等［9］研究相反，他们发现尼古丁可以通过α7nAChR激活DCs，并且促进DCs成熟，从而活化T细胞启动免疫反应，尼古丁的这些作用可能是导致动脉粥样硬化继续进展的主要原因。作者认为产生这种矛盾现象的根本原因是DCs的分化状态不同所导致的。在本实验中，经过尼古丁的刺激，小鼠体内的CD11clowCD45RBhighDCs显著增加，对应的IL－10显著升高，抑制了体内炎性反应的继续进展，另一方面，CD11clowCD45RBhighDCs的数量却是降低的，此亚群主要以分泌IL－12为主，促进机体发生炎性反应。由此，推测尼古丁可能促进DCs向CD11clowCD45RBhighDCs发展，从而减弱SAP的炎性反应，增加SAP小鼠的生存率。

总之，本实验结果提示干预胆碱能抗炎通路对SAP具有一定的保护作用。但尼古丁对SAP的预防和保护作用的机制还有待进一步研究。不过相信随着对胆碱能抗炎通路与SAP相互关系的深入研究，困扰人们的问题终将得到解释。而胆碱能抗炎通路也有可能成为治疗SAP的有效措施，为SAP的治疗开启新的篇章。

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