龟峰山古杜鹃群落遗传多样性的ISSR研究

王书珍等

摘要：采用简单序列重复区间扩增多态性分子标记（Inter -simple sequence repeat， ISSR）技术，对龟峰山3个野生杜鹃（Rhododendron simsii Planch.）居群共23个种质材料进行了遗传多样性分析与评价。运用40条ISSR引物共筛选出7条扩增条带清晰、重复性好和多态性高的引物；筛选出来的7条ISSR引物共扩增出79条清晰的条带，其中多态性条带有74条，平均多态性位点比率为93.67%，等位基因数Na和有效等位基因数Ne分别为1.962 0和1.555 4，奈氏基因多样性指数h为0.330 8 ，香农氏信息指数I为0.499 0，表明龟峰山古杜鹃群落具有较高的遗传多样性，其中Rho-M和Rho-H两个居群之间的遗传距离小至0.069 8，亦即这两个居群之间的分化最小。试验从分子层面对古杜鹃的遗传多样性分析将对龟峰山古杜鹃种质资源的评价、保存以及杜鹃新品种的选育提供理论支撑。

关键词：杜鹃（Rhododendron simsii Planch.）；简单序列重复区间扩增多态性分子标记；遗传多样性；种质资源；龟峰山

中图分类号：S685.21；Q503；Q16（634MC） 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2931-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.031

Genetic Diversity Analysis of Ancient Rhododendron simsii from

the Guifeng Mountain by ISSR Markers

WANG Shu-zhen，ZHA San-sheng，FANG Jiao，LI Zhi-liang，ZHANG Ming-ju，GAN Jian-ping，JIN Wei-bin

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/College of Chemistry and Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： Genetic diversity of three wide rhododendron（Rhododendron simsii Planch.） populations （23 individuals in total） sampled from the Guifeng Mountain， was evaluated with Inter -simple sequence repeat （ISSR） markers. Among the 40 ISSR primers，7 could amplify clear and high polymorphic bands. Additionally， the polymorphic ISSR markers gave out 79 clear bands， and 74 of them were polymorphic， with a ratio of 93.67%. Simultaneously， the Na and Ne were 1.962 0 and 1.555 4， respectively；Neis gene diversity （h） and Shannons information index （I） were 0.330 8 and 0.499 0，respectively. Results showed that genetic diversity of Guifeng Mountain R. simsii population was high， and the genetic distance between populations Rho-M and Rho-H was just 0.069 8， as indicated the low genetic differentiation between populations. Therefore， this study will provide theoretical basis towards the future evaluation， preservation and breeding selection of R. simsii.

Key words：Rhododendron simsii Planch.；Inter-simple sequence repeat；genetic diversity； germplasm resources；Guifeng Mountain

杜鹃（Rhododendron simsii Planch.）被誉为“花中西施”和“木本花卉之王”，属于杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron L.）木本植物，在亚洲、欧洲、北美洲等地广泛分布[1，2]。中国约有571个杜鹃花品种，特有种（类型）多达400多个，并且在滇藏川交汇处的横断山脉是世界上杜鹃花的发源地和分布中心[3]。杜鹃兼有生态保护、园林观赏、药用植物、科学研究等多重功效，尤其是其水土保持功能突出，在山地生态系统的维持中举足轻重[1]。位于湖北省麻城市龟峰山的杜鹃花灌丛因其面积大、结构纯、树龄长而成为当下颇具吸引力的风景区，具有很高的景观利用价值；而从长远来看，杜鹃资源的保护和永续利用与大别山区域的社会经济发展大局紧密相关，并且其作为植物基因库的科研价值和自然遗产价值更是不可估量。

遗传多样性是生物多样性的核心，是物种适应环境的物质基础和进化的内在动力，也是保护生物学研究的重点所在。利用分子标记技术可以快速、高效检测物种的多样性，以便更全面地评价种质资源。简单序列重复区间扩增多态性分子标记（Inter -simple sequence repeat，ISSR）是建立在聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）基础上的一种新型的分子标记方法，具有操作简单、重复性好、多态性丰富、信息量大的优点，已经广泛应用于植物遗传图谱构建、基因定位、遗传多样性分析、分子生态学研究、植物品种鉴定等研究领域里[4-9]。试验从分子水平层面探讨了野生杜鹃种质资源的遗传结构、亲缘关系和遗传多样性，以期为龟峰山野生杜鹃种质资源的综合评价、保护和新品种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

杜鹃花种质资源于2013年8～12月采自湖北省麻城市龟峰山风景区，3个居群分别采自不同的海拔区域，具体信息见表1。分别采集各居群的新鲜叶片后放入自封袋内，并置于冰盒中带回实验室，于-80 °C冰箱里保存备用。

1.2 方法

1.2.1 杜鹃基因组DNA提取和ISSR-PCR反应体系的建立 在经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室内将采集的新鲜无病虫害杜鹃叶片洗净、晾干，并依据前期研究（另文发表）结果选用3×CTAB法提取23份杜鹃样本的DNA。1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后在紫外分光光度计下测定其浓度，并将DNA浓度统一稀释至50 ng/μL。在前期研究中，我们从模板DNA量、ISSR引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度等5个因素在4个水平上进行了正交试验，建立了适合杜鹃花的ISSR-PCR扩增体系，本试验采用了这个扩增体系，所采用的20 μL ISSR-PCR反应体系为：模板DNA 60 ng，ISSR引物为0.60 μmol/L，Taq DNA聚合酶浓度30 U/mL，Mg2+浓度为0.6 mmol/L，dNTPs浓度0.50 μmol/L。

1.2.2 ISSR引物扩增 挑选1个杜鹃种质材料的DNA，设置温度梯度进行PCR扩增，以筛选每条ISSR引物的最适温度。分别从3个居群内各挑选出2个种质材料，对40条ISSR引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）进行初步筛选。将初筛中扩增效率高且稳定性强的引物对3个居群共23个杜鹃种质材料分别进行二次扩增。PCR扩增程序为：94 °C预变性10 min；94 °C变性40 s，在最适退火温度下退火40 s，72 °C延伸100 s，35个循环；最后在72 °C延伸10 min。

1.2.3 带型统计和多样性分析 利用5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ISSR-PCR的扩增产物，根据DNA条带在凝胶上出现的有、无进行统计，有条带的记为1，无条带的记为0，然后把数据输入Microsft Office Excel 2007软件内保存。将数据输入Popgene 32软件内，利用软件自带的公式对3个杜鹃居群的遗传多样性参数，包括等位基因数Na、有效等位基因数Ne、奈氏基因多样性指数h、香农氏信息指数I、群体遗传一致度、遗传距离进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR体系的建立

试验采用的20 μL ISSR-PCR反应体系扩增的部分结果见图1，该图是利用引物ISSR 21对部分杜鹃种质材料的扩增结果，在试验范围内具有一定的代表性。

2.2 ISSR引物扩增结果

利用40条ISSR引物对6个杜鹃种质材料的DNA进行扩增，共筛选出16条可以稳定扩增的引物。在二次扩增时，对23个杜鹃种质材料的DNA进行筛选，共筛选出了7条扩增条带清晰、重复性好和多态性高的引物，具体见表2。这7条引物每条能扩增出来的条带为5～17条，以RhoW10扩增的条带最少，仅扩增出5个条带；而RhoW21引物在杜鹃基因组DNA内的结合位点多达17个。

2.3 遗传多样性分析

将通过二次扩增筛选得到的7个引物对野生杜鹃3个居群23个种质材料进行ISSR扩增，共得到79个条带，其中多态性条带有74条，多态性比率为93.67%（表2），DNA条带的相对分子质量分布在100～2 000 bp。

对野生杜鹃3个居群ISSR扩增产物进行遗传多样性分析，结果见表3。从表3可见，23个杜鹃种质材料每个位点的等位基因数Na为1.658 2～1.848 1（因数据篇幅过大，文中省略；下同），平均为1.767 9；每个位点的有效等位基因数Ne为1.421 2～1.498 1，平均为1.468 2；每个位点的奈氏基因多样性指数h为0.243 0～0.297 8，平均为0.275 1；每个位点的香农氏信息指数I为0.360 7～0.448 0，平均为0.411 5。所采集的龟峰山杜鹃种质资源在DNA分子水平上整体具有较高的遗传多样性，其整体奈氏遗传多样性指数h高达0.330 8，香农氏信息指数I为0.499 0。并且样品代表性较强，采样地分布均匀，因此龟峰山野生杜鹃居群的整体多样性较强。

在3个不同海拔高度的杜鹃群体内，以低海拔的Rho-L群体的遗传多样性最高，其奈氏基因多样性指数h高达0.297 8；遗传多样性最低的是高海拔的Rho-H群体，其奈氏基因多样性指数h仅为0.243 0。说明随着高度的增加，龟峰山野生杜鹃居群的遗传多样性有逐渐降低的趋势。山顶地区的遗传退化和多样性降低可能是环境因素引起的，龟峰山上的乔木资源比较少，作为灌木丛生长的野生杜鹃几乎裸露，而且海拔越高其裸露程度越强，生存环境越恶劣，故此推测群落结构简单可能是导致其遗传多样性程度降低的主要原因之一。

2.4 遗传相似性分析

利用Popgene 32软件分析了3个杜鹃居群的遗传相似性，结果见表4。从表4可见，居群Rho-M和Rho-H之间的遗传距离最小，为0.069 8；而Rho-H与Rho-L之间的遗传距离最大，高达0.152 1，即两者之间的亲缘关系最远；Rho-M与Rho-L之间的遗传距离居于中间。因此，龟峰山海拔1 091 m处的Rho-M群体和1 182 m处的Rho-H群体的杜鹃花资源其DNA相似度最高，在进化上更趋向于协同，可能的原因是两个群体的海拔高度比较接近、生态环境较为相似造成的，说明景观生态条件对杜鹃居群的影响较为相近。遗传一致度的分析也证明了这一点。

3 讨论

遗传多样性是物种长期进化的结果，遗传多样性越高，则种质资源在DNA分子水平上存在的差异就越大，物种的适应能力和抵抗环境选择压力的能力就越强，进化的潜力就越大，越有助于保护物种和整个生态系统的多样性，并且可供进一步选择、保存和利用的潜力就越大[10，11]。北热带中低海拔区的龟峰山（115°08E-115°18E，31°03N-31°07N，主峰海拔1 320 m）位于鄂豫皖三省交界处的湖北省麻城市。因漫山遍野的杜鹃花（主要为映山红亚属，Rhododendron subgen. Tsutsusi）被中国花卉协会命名为“中国映山红第一城”，当地现在已将杜鹃花资源优势转化为产业优势，大力营造浓厚的杜鹃花氛围，在推动杜鹃花产业发展的同时带动了地区旅游业及周边地区花卉产业的发展；“人间四月天，麻城看杜鹃”的国家级旅游品牌已经成功叫响，并且极大地促进了地方经济的发展。因此，对龟峰山野生杜鹃资源的遗传多样性评估也就显得尤为重要[12]。

ISSR分子标记多次被用于研究杜鹃居群的遗传多样性。金则新等[13]利用12对ISSR引物对浙江省内的5个云锦杜鹃（R. fortunei Lindl.）自然居群的遗传多样性进行了分析，发现云锦杜鹃物种水平的遗传多样性很高，而居群水平的遗传多样性较低；并认为居群隔离、自交衰退可能是导致云锦杜鹃居群间遗传分化的主要原因。刘旭颖等[14]用13个ISSR标记对辽宁省的9种耐寒杜鹃花亲缘关系进行了分析并构建了系统树，结果发现分子标记分类结果与与形态学分类结果基本一致。赵芯等[15]用12个ISSR引物对浙江大明山4个麂角杜鹃（R. latoucheae Franch.）种群的遗传多样性和遗传分化进行分析，发现麂角杜鹃种群的遗传多样性较高，其奈氏遗传多样性指数h为 0.309 9，香农氏信息指数I为 0.464 0。赵凯等[16]用8个ISSR 标记对5个都支杜鹃（R. shanii Fang）居群扩增后发现多态位点比率为52.17%，物种水平的香农氏信息指数I为 0.253 6，奈氏遗传多样性指数h为0.165 9，奈氏基因分化系数GST=0.184 5，基因流Nm=2. 210 4，并推测较强的基因流、多年生木本及异交与分布区狭窄等是导致都支杜鹃遗传多样性较低的主要原因。刘雁飞等[17]利用ISSR分子标记研究了长白山北坡4个不同海拔高度的牛皮杜鹃（R. chrysanthum Pall.）自然居群的遗传多样性及遗传结构，揭示出该物种具有较高的遗传多样性水平，且随着海拔梯度由低到高而增大；并认为除了繁殖策略之外，长白山当地的地理环境对牛皮杜鹃居群遗传多样性和遗传结构的塑造起到了重要作用。

在本研究中，我们发现龟峰山杜鹃居群整体水平上具有较丰富的遗传多样性，但随着海拔的增高，其遗传多样性有逐渐降低的趋势，这可能与龟峰山山顶地区几乎无乔木遮盖的生态环境有关。因此我们认为龟峰山山顶地区的杜鹃居群存在着较高的遗传风险，在后期的保护实施中更应该重点关注山顶地区的野生杜鹃居群。本研究利用ISSR标记在分子水平上揭示了龟峰山野生杜鹃资源的种群结构，这将为龟峰山古杜鹃种质资源的评价、保存以及杜鹃新品种的选育提供理论支撑。

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