HIV/HCV共感染者外周血辅助性T细胞17和IL-17A水平检测*

丁佩佩，何　纲，陈晓华，甄沛林，吴兴柳，胡长征

HIV/HCV共感染者外周血辅助性T细胞17和IL-17A水平检测*

丁佩佩，何纲，陈晓华，甄沛林，吴兴柳，胡长征

【摘要】目的探讨HIV/HCV共感染者外周血辅助性T细胞17（Th17）及白细胞介素（IL）-17A的免疫调节作用。方法随机选取HIV/HCV共感染者、HIV感染者、HCV感染者和健康人各30例，使用流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞数量和Th17数量，采用ELISA法检测血清IL-17A水平。结果HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴细胞分别为（310.23±114.35）个/μl和（218.42±112.47）个/μl，均较健康人明显降低［（735.46±121.52）个/μl，P＜0.05］，HIV/HCV共感染者较HIV感染者CD4+T淋巴细胞更低（P＜0.05），HCV感染者CD4+T淋巴细胞数为（719.47±123.72）个/μl，与健康人比较无显著性差异；HIV感染者Th17百分比和IL-17A水平分别为（2.48± 0.90）%，和（25.18±12.63）pg/ml，均较健康人显著降低［（3.95±1.23）%和（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］，HCV感染者Th17百分比和IL-17A为（5.48±0.90）%和（45.24±15.72）pg/ml，显著高于健康人（P＜0.05），而HIV/HCV共感染者Th17百分比为（1.76±0.42）%，IL-17A为（16.49±7.54）pg/mL，均显著低于HIV感染者［（2.48±0.90）%和（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］。结论合并HCV感染可能通过影响Th17及其细胞因子IL-17A进一步影响HIV患者的免疫功能。

【关键词】丙型肝炎；艾滋病；T淋巴细胞；辅助性T细胞17；白细胞介素17A

HIV和HCV两种病毒有着共同的传播途径，故两者合并感染率高。据有关流行病学研究报告，我国静脉吸毒人群HIV/HCV合并感染率高达69.0%～93.6%［1，2］。有研究者认为HCV的合并感染会加速HIV感染者的疾病进程［3，4］。也有研究者认为HIV感染能加速HCV RNA复制，加快疾病进展，增加患肝硬化和肝癌的风险［5］。HCV感染可引起复杂的病理过程，机体的辅助性T细胞及细胞毒性T细胞参与了抗病毒的免疫应答反应。HIV感染可以导致机体免疫功能失调，CD4+辅助性T细胞亚群减少，特异性细胞毒T细胞应答丧失。那么，在HCV/HIV合并感染的复杂状态下，机体免疫功能失调会出现哪些变化？与HIV或HCV单纯感染比较会有哪些不同？这些问题目前还不完全清楚，因而对其T淋巴细胞免疫调控机制的研究具有极其重要的意义。Th17细胞是近年来发现的新的CD4+T细胞亚群，能够产生一系列的细胞因子，发挥重要的免疫调节作用，已成为一个重要的研究热点。Th17细胞不但可以通过其分泌的细胞因子参与各种炎症反应的发生，同时也可以与其他免疫细胞亚群之间相互作用，发挥负性免疫调节作用，将固有免疫与获得性免疫有机地联系起来。研究Th17及其细胞因子的变化对明确HIV/HCV共感染者的免疫调控有重要意义。本研究比较了HIV/HCV共感染者与HIV感染者、HCV感染者和健康人Th17细胞及其细胞因子水平的变化，以探讨其在病毒混合感染发病中的作用。

1　资料与方法

1.1一般资料2012年1月至2014年3月我院就诊的HIV/HCV共感染者30例，男18例，女12例；平均年龄（43.12±11.05）岁。HIV感染者30例，男20例，女10例；平均年龄（38.25±15.12）岁。HCV感染者30例，男21例，女9例；平均年龄（35.75±12.34）岁。以上3组患者均未接受抗病毒治疗。HIV感染者符合2005年中国《艾滋病诊疗指南》的诊断标准［6］，排除合并机会性感染患者；HCV感染者符合2004年我国发布的《丙型肝炎防治指南》的诊断标准［7］，排除肝硬化患者；HIV/HCV共感染者同时符合HIV感染和HCV感染诊断标准，排除合并机会性感染患者及肝硬化患者。以上各组患者均排除高血压、冠心病、糖尿病、恶性肿瘤等慢性疾病。各组患者年龄和性别差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。另选健康体检者30例，男19例，女11例；平均年龄（40.12±13.05）岁。本研究在我院医学伦理委员会备案，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2试剂与仪器RPMI 1640培养液、胎牛血清、淋巴细胞分离液均由美国Gibco公司提供；佛波酯（PMA）、离子霉素（ionomycin）购自美国Sigma Aldrich公司；莫能霉素（monensin）、抗人CD4 PE、抗人IL-17 APC-A购自美国eBioscience公司；抗CD45-CD3-CD4组合抗体和荧光微球购自美国Beckman公司；人白介素-17A（IL-17A）ELISA试剂盒由西唐科技生物有限公司提供；酶标仪（DENLEY DRAGON Wellscan MK 2）及洗板机（Wellwash 4 MK2）由芬兰Thermo公司生产；流式细胞仪（MACS Quant SN2187）由德国Miltenyi公司生产。

1.3 CD4+T细胞检测于清晨空腹采集肝素抗凝全血8 m1，2 h内用人淋巴细胞分离液分离血浆和外周血单个核细胞（PBMC）。血浆和PBMC置-80℃冻存。血浆用于检测细胞因子，PBMC用于检测Th17细胞。在各样品反应管中加入EDTA抗凝全血100 μl，加入相应的抗CD45-CD3-CD4组合抗体10 μl，轻轻混匀。避光孵育20 min。用相配套溶血素A、B、C液溶血。加入荧光微球100 μl。以CD45阳性细胞设门，收集细胞，流式细胞仪分析CD3+CD4+双阳性T淋巴细胞群。

1.4 Th17细胞检测取上述PBMC，加入刺激剂佛波酯25 ng/ml，离子霉素1 μg/ml和蛋白质转运抑制剂莫能霉素1.7 μg/ml，在37℃、5%CO2细胞培养箱培养4 h。收集细胞，根据计数等分为测定管和同型对照管。加入藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人CD8单抗20 μl、藻红蛋白-青色素染料5（PE—Cy5）标记的鼠抗人CD3单抗10 μl，4℃避光孵育20 min。加固定液，室温避光固定反应15 min，离心，弃上清，PBS洗涤2次。加入破膜剂，进行细胞打孔，以利于胞内细胞因子染色。在测定管中加入IL-17A-FITC，进行胞浆染色，在对照管中加入相应的同型对照，4℃避光孵育30 min。PBS洗涤2次，将细胞悬浮于PBS液0.5 ml中。在流式细胞仪上，根据CD3-SSC设门，分析CD8阴性细胞群，检测Th17细胞。

1.5血清细胞因子检测采用ELISA法检测血清IL-17A水平。

1.6统计学处理应用SPSS l3.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验标准，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组人群外周血CD4+T淋巴细胞和Th17细胞计数的比较HIV感染者和HIV/HCV共感染者外周血CD4+T淋巴细胞均较健康人降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者CD4+T淋巴细胞较HIV感染者更低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HCV感染者CD4+T淋巴细胞与对照组比较无明显差异（P＞0.05）；HIV感染者Th17百分比较健康对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者Th17百分比比HIV感染者更低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HCV感染者Th17百分比较健康人升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1　4组人群外周血CD4+T淋巴细胞和Th17细胞计数（x±s）的比较

2.2血清IL-17A水平比较HIV感染者Th17型细胞因子IL-17A较健康人降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HIV/HCV共感染者IL-17A比HIV感染者更低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HCV感染者IL-17A较健康人升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2　4组人群血清IL-17A水平（x±s）比较

3　讨论

HIV感染是一个缓慢进展的长期免疫损伤过程。在急性感染阶段，HIV大量复制，人体内CD4+T细胞被大量破坏，免疫系统显著受损；在慢性无症状期，HIV与人体免疫系统达到一个相对平衡，但病毒的持续复制仍不断摧毁免疫系统，体内CD4+T细胞不断下降，最终导致免疫系统衰竭，出现各种机会性感染和肿瘤。因为存在共同的传播途径，HIV/HCV共感染情况在临床较为常见。目前，世界上HIV与HCV共感染者约为四五百万人［8］，在静脉吸毒人群中，HIV合并感染HCV者高达90%［9］。由于两种疾病的相互影响，HIV/HCV共感染者往往病情更复杂。HIV/HCV均可以损害人体的免疫细胞，对于两者共感染情况的免疫功能变化研究对明确HIV/HCV共感染者的发病机制有重要意义。国内外均有研究发现，HIV/HCV共感染者CD4+T细胞水平较单纯感染者更低［10～13］，但机制尚不清楚。我们研究的结果也证实了这一点，HIV感染者和HIV/HCV共感染者CD4+T细胞水平较健康人明显降低，其中HIV/HCV共感染者CD4+T细胞水平比HIV感染者更低，但HCV感染者CD4+T细胞水平与健康人无明显差异。由于CD4+T细胞水平与AIDS发病进程密切相关，故HIV/HCV共感染者较单纯HIV感染者更容易进入发病期。HCV合并感染可能影响了HIV感染者的免疫功能，加速了HIV的发病过程。

Th17细胞是一种新的CD4+效应T细胞亚型，来源于Th0，具有与Th1、Th2不同的独立分化途径，具有强大的促炎作用［14］，它的发现不仅弥补了Th1/Th2细胞轴介导免疫效应的不足，而且完善了Th1/Th2免疫调节理论。Th17细胞参与体内炎症反应，在各种炎性疾病和自身免疫性疾病中均有重要意义［15～18］。Th17主要通过分泌细胞因子，募集活化中性粒细胞，刺激上皮细胞，产生防御作用，介导炎症反应。Th17细胞分泌的细胞因子主要包括IL-17、IL-6、IL-22、IL-21 和TNF等，这些细胞因子具有动员、募集及活化中性粒细胞的功能［15］，而其中最重要的效应因子是IL-17。IL-17家族包括 IL-17 A～F共 6位成员，其中IL-17A能产生较强的致炎效应［16］。Thl7的反应很可能早于Thl或Th2型免疫反应，出现在感染的早期阶段，诱发组织炎症，并通过细胞因子的诱导，桥接先天免疫和适应性免疫，在炎症后期吸引其他亚群的T细胞，向感染部位募集。有研究显示，HIV感染者体内Th17明显减少，而且其在HIV感染的早期就出现明显降低［19］，但其发生机制尚不明确。也有研究发现，HCV感染者体内Th17有升高，其升高程度与干扰素的治疗效果相关［20］。虽然目前对Thl7细胞与HIV/HCV的研究仅处于初步探索阶段，但是相信随着不断的深人研究，其在免疫损伤机制中的作用将有可能被阐明。

我们的研究发现HIV感染者 Th17细胞及IL-17A水平均较健康人明显降低，差异有统计学意义，说明HIV感染可能通过Th17细胞及其细胞因子IL-17A影响患者的免疫功能。相反，HCV感染者Th17细胞及IL-17A水平均较健康人明显升高，差异有统计学意义，说明HCV感染也可引起Th17及其细胞因子的变化，此种变化为上调Th17细胞和IL-17A水平，也可影响患者的免疫功能。

那么，HIV和HCV的合并感染是否会对HIV感染者Th17细胞及IL-17A水平造成影响，从而进一步影响HIV感染者的免疫功能呢？目前国内外在这方面的研究比较少见。本研究发现HIV/HCV共感染者Th17细胞及IL-17A水平未如预期的那样低，或许受到HCV的共同作用而使其处于两组单纯感染者的中间水平，反而是较HIV单纯感染者更低，差异有统计学意义。故我们认为在HIV/HCV共感染者中，HCV的合并感染进一步加剧了患者Th17细胞及IL-17A水平的损害，并可能通过Th17通道进一步损害患者的免疫功能，最终加快HIV的发病过程。

我们的研究表明HCV合并感染可能通过影响Th17及其细胞因子IL-17A进一步损害HIV患者的细胞免疫功能。加强对Th17及其细胞因子IL-17A的研究将有助于进一步理解HIV/HCV共感染者的发病机制，为新的治疗策略提供重要的研究方向。

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（收稿：2014-07-07）（本文编辑：陈从新）

第一作者：丁佩佩，女，34岁，医学硕士，副主任医师。主要从事传染病临床与科研工作。E-mail：dingpeipei120@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.008

*基金项目：广东省江门市科技计划项目（编号：江科［2012］107-70）

作者单位：529030广东省江门市中心医院感染病科

Th17 cell counts in peripheral blood and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients Ding Peipei，HeGang，ChenXiaohua，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，JiangmenCentralHospital，Jiangmen 529030，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To explore the changes in Thl7 cell counts and serum IL-17A levels in HIV/HCV co-infected patients.Methods Thirty HIV/HCV co-infected patients，30 HIV infected patients，30 HCV infected patients and 30 healthy subjects were selected in this study.The percentage of CD4+T cells and Th17 cells in peripheral blood，and IL-17A in sera were detected by FCM and ELISA，respectively.Results The percentage of CD4+T cells in HIV and HIV/HCV co-infected patients were（310.23±114.35）/μl and（218.42±112.47）/μl，respectively，both were significantly lower than that in the healthy controls［（735.46±121.52）/μl，P＜0.05］，while the percentage of CD4+T cells in HIV/HCV co-infected group was even lower than in HIV infected patients（P＜0.05）；There was no significant difference in CD4+T cells between HCV infected patients［（719.47±123.72）/μl］ and the controls；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV infected patients were（2.48±0.90）%and （25.18±12.63）pg/ml，significantly lower than those in the controls［（3.95±1.23）%and（39.15±16.30）pg/ml，P＜0.05］；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HCV infected patients were（5.48±0.90）%and （45.24±15.72）pg/ml，significantly higher than those in the controls（P＜0.05）；The percentage of Th17 and serum level of IL-17A in HIV/HCV co-infected patients were（1.76±0.42）%and（16.49±7.54）pg/ml，both significantly lower than those in HIV infected patients［（2.48±0.90）%and（25.18±12.63）pg/mL，P＜0.05］.Conclusions Co-infection of HCV may influence the immune response in HIV infected patients，which might lead to the involvement of Th17 and IL-17A cytokine.

【Key words】Hepatitis C；Human immunodeficiency virus；T lymphocytes；T helper cell 17；Interleukin 17A