大理苍山两条溪流中水生丝孢菌资源调查及比较

刘晓英，罗宗龙，李琴艳，王如潇，陶星辰，王立伟，苏鸿雁*

（1.大理学院基础医学院，云南大理　671000；2.大理学院农学与生物科学学院，云南大理　671003）

大理苍山两条溪流中水生丝孢菌资源调查及比较

刘晓英1，罗宗龙2，李琴艳2，王如潇1，陶星辰1，王立伟2，苏鸿雁2*

（1.大理学院基础医学院，云南大理671000；2.大理学院农学与生物科学学院，云南大理671003）

［摘要］目的：调查黑龙溪和万花溪水生真菌资源，比较其差异性。方法：2013年3月份从黑龙溪和万花溪中各采集沉水腐木50份，采用保湿培养法对水生真菌进行培养，基于形态学特征对水生真菌进行鉴定。结果：共分离鉴定出48种水生丝孢菌，万花溪30种，黑龙溪21种，Kostermansinda nanum、Phaeoisaria clematidis和Sporidesmiella rosae在两条溪中都有出现。结论：黑龙溪和万花溪中水生真菌资源丰富，人工建坝对真菌群落有影响。

［关键词］水生真菌；资源；调查；沉水腐木

［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2015.06.015

水生真菌在生态系统中具有非常重要的作用〔1〕。据估计，全球约有1.5亿种真菌〔2〕，但已发现的真菌只占5%，大约7万种，且多数为陆地真菌〔3〕。尽管从上个世纪40年代开始就有水生真菌的报道，但与陆地真菌相比较，对这一类群真菌的多样性仍然知之甚少〔4〕。直到2007年，大约3 000种真菌报道于水环境〔5-6〕。对水生真菌的研究主要集中于欧洲、北美洲及东南亚地区〔7〕，世界上仍有很多地区，例如中国大陆、非洲、南美洲、澳大利亚、北极地区以及全球范围内的热带地区的水生真菌研究工作有待加强〔5〕。在热带和亚热带地区，已经有许多水生真菌报道于河流或小溪，如香港〔8〕、昆士兰北部、澳大利亚和塞舌尔〔9-10〕。在温带地区尤其是美国和英国〔11-13〕也有相应报道。

云南具有复杂的气候和自然环境，20世纪80年代杨发蓉和丁桦孙对滇池〔14〕、洱海〔15〕、长湖〔16〕等地的水生真菌进行过研究，但其研究对象基本是低等水生真菌。2000年，云南大学研究人员开始在云南不同地域对水生真菌群落多样性及其生态学方面进行了系统性研究〔17-21〕。迄今为止，未见关于大理苍山十八溪水生丝孢菌的研究报道。本项目对苍山黑龙溪和万花溪中沉水腐木上的水生丝孢菌资源进行调查，并进行比较分析，所得结果将为后续研究提供数据支持。

1　材料与方法

1.1样品采集苍山位于大理州中部，呈南北走向，地跨东经99°54′30′′～100°12′12′′、北纬25°33′30′′～25°59′48′′，最高点海拔4 122 m，万花溪和黑龙溪分别为苍山东坡十八溪中由北往南的第二溪和第十四溪〔22〕。2013年3月份，分别沿黑龙溪和万花溪岸边，由下游往上游各随机采集样品50份。采集的样品为长期浸泡在溪水中的腐木，腐烂程度一般通过肉眼即可判断，采集时尽量选择表皮脱落，指甲掐压时松软的木头。腐木大小以直径1～5 cm，长20～30 cm为宜。采集到的样品装入自封袋中带回实验室进行保湿培养。

1.2培养基PDA培养基：马铃薯去皮200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水加至1 000 mL。

WA培养基：琼脂18 g，蒸馏水加至1 000 mL。MEA培养基：麦芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，琼脂18 g，蒸馏水加至1 000 mL。以上培养基经高压蒸汽灭菌（121℃，20 min），待其冷却至50℃以下加入氨苄青霉素，终浓度为100 μg/mL，倒入无菌平板中备用。

1.3样品处理将采集回来的样品按地点编号后放入用酒精消毒后的封闭塑料盒中，盒底铺上灭菌的吸水纸用于保湿，吸水纸上再放上灭菌吸管适当隔离，喷洒适量无菌水，室温条件下进行培养，一周后开始观察。在体视镜下观察到真菌子实体后，用大头针标记出观察到的区域，再用解剖针挑出目的真菌制成水玻片，在OLYMPUS BX51显微镜下观察并使用Image-Pro Express C软件拍照并测量。采用单孢分离技术，在无菌操作台中将孢子用无菌解剖针或削尖的牙签转接到事先准备好的PDA平板中，室温培养24 h后观察萌发，待其萌发后挑取一到两个孢子制片并在显微镜下观察并拍照，平板上其余孢子单个转移到新的PDA或MEA上，室温培养观察菌落形态。干标本及纯培养一式三份进行保存。

1.4水生丝孢菌鉴定查找相关文献〔23-25〕，根据分生孢子梗和产孢细胞的形态特征以及分生孢子的形成方式、大小、形状、颜色、分隔、附属物、内部有无油滴状内含物等特征将其鉴定到属、种。

1.5水生丝孢菌统计

水生丝孢菌出现频率（%）=（某个种出现次数/样品总数）×100%

比较黑龙溪和万花溪中水生真菌物种组成相似性，采用辛普森相似指数（S）进行比较〔26〕。

S=2c/（a+b），其中，a=黑龙溪中的水生丝孢菌种数，b=万花溪中的水生丝孢菌种数，c=在两条溪中都有的水生丝孢菌种数，S=0表示不相似，S=1表示完全相似。

采用香农-威纳指数（H）来反映黑龙溪和万花溪中水生丝孢菌多样性〔21〕。

其中，Ni=第i个种的检出次数，N=所有种的检出次数，lnpi=pi的自然对数。

2　结果

在黑龙溪和万花溪中采集并鉴定出水生丝孢菌共48种，其中黑龙溪30种，万花溪21种，见表1。从形态上初步鉴定出13个可能的新种（在表1中以属名+sp.表示），还需进一步采用分子生物学技术来确定这些新种的分类地位。黑龙溪中常见种为Helico⁃sporiumguianense、Sporidesmium adscendens、Hel⁃minthosporium velutinum。万花溪中常见种为Helico⁃myces tenuis、Phaeoisaria clematidis、Monodictys moni⁃licellularis。两条溪共有的种只有3个，分别是Kos⁃termansinda nanum、P.clematidis、Sporidesmiella ro⁃sae，而且他们出现的频率也不一样。通过计算得出黑龙溪和万花溪中水生真菌物种组成的相似指数为0.12（见表1），说明这两条溪中水生丝孢菌具有较大差异。黑龙溪和万花溪中水生丝孢菌的香农-威纳指数（H）分别为3.67和2.22（见表1），表明黑龙溪中的水生丝孢菌多样性明显高于万花溪中的水生丝孢菌多样性。

表1　黑龙溪和万花溪中沉水腐木上水生丝孢菌出现频率

续表

3　讨论

Shearer等〔5〕在2007年预测淡水中有大量的真菌有待发现，本次研究选取苍山十八溪中的两条溪进行研究，发现了13个可能的新种，与这一预测相符；从调查结果可知，黑龙溪和万花溪中水生丝孢菌资源丰富，其中以K.nanum、P.clematidis和S.rosae为常见种，苍山另外十六条溪中的水生真菌还有待研究。

黑龙溪和万花溪中真菌群落差异性较大，万花溪中的水生丝孢菌的多样性低于黑龙溪中的水生真菌多样性。影响淡水生境中水生丝孢菌群落及多样性的因素有很多，主要包括：生境、水质、水污染、真菌生长基质、地理气候条件、岸边植被等〔21〕。水生真菌的淡水生境一般分3种类型：静态生境（如湖泊、池塘、水池、沼泽地等）、动态生境（如河流、溪流等）和人工生境（如冷水塔、人工水库等）〔27〕。本研究选取的黑龙溪和万花溪皆属于动态生境，淡水生境一致。马根连于2012年对苍山十八溪水质进行监测评价，其中万花溪和黑龙溪出山口水质均为Ⅱ类〔28〕，可认为两条溪流水质基本相同。两条溪相距19 km左右，地理气候条件差异不大，岸边植被种类也类似，在采集沉水腐木过程中皆是随机采集，因此，两条溪流的地理气候条件、岸边植被、真菌生长基质的差异不大。万花溪水电站于1960年建成，在万花溪上游修建了蓄水大坝，大坝附近植被遭到破坏，截流蓄水导致万花溪下游出现断流现象，进而影响水生真菌的生存环境。本研究认为两条溪真菌群落差异较大并且万花溪中的水生丝孢菌的多样性低于黑龙溪中的水生真菌多样性的主要原因是修建了蓄水大坝，这一结论与胡殿明〔21〕所持观点相同。

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（责任编辑毛本勇）

［中图分类号］Q948

［文献标志码］A

［文章编号］1672-2345（2015）06-0058-04

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（31360013；31460015）；云南省中青年学术带头人资助项目（2012HB-042）；云南省高校滇西生物多样性科技创新团队基金资助项目（云教函〔2011〕93号）；大理学院质量工程项目（TDI-05）

［收稿日期］2015-03-30［修回日期］2015-04-14

［作者简介］刘晓英，硕士研究生，主要从事微生物及疾病研究.

*通信作者：苏鸿雁，教授.

Investigation and Comparison of Freshwater Hyphomycetes between Two Streams in Cangshan Mountain in Dali

Liu Xiaoying1，Luo Zonglong2，Li Qinyan2，Wang Ruxiao1，Tao Xingchen1，Wang Liwei2，Su Hongyan2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Agriculture and Biology Science，Dali University，Dali，Yunnan 671003，China）

〔Abstract〕Objective：To find out the resources of freshwater hyphomycetes from Heilong Stream and Wanhua Stream and compare their differences.Methods：50 samples were collected from each stream，using Moist Incubation Method to incubate the fungi，identifying the fungi based on the morphological characters.Results：48 species of freshwater hyphomycetes were find out with 30 species from Heilong Stream and 21 species from Wanhua Stream.Kostermansinda nanum，Phaeoisaria clematidis and Sporidesmiella rosae were found from both streams.Conclusion：The resources of freshwater hyphomycetes are abundant in Heilong Stream and Wanhua Stream，and artificial dam can affect the communities of freshwater fungi.

〔Key words〕freshwater fungi；resources；investigation；submerged decayed wood