余甘子叶提取物对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响

罗雪菲，顾国龙，兰太进（.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁　5300；.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁　53000）

余甘子叶提取物对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响

罗雪菲1，顾国龙1，兰太进2
（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530011；2.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁530200）

摘要：［目的］观察余甘子叶提取物（PL）对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响。［方法］建立H22荷瘤小鼠模型，灌胃给予余甘子叶提取物高、中、低剂量（1.982，0.991，0.496 g/kg），观察余甘子叶提取物对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响。［结果］余甘子叶提取物高、中剂量（1.982，0.991 g/kg）能显著提高荷瘤小鼠T淋巴细胞及其CD4+亚群相对数量（P＜0.05），上调CD4+/CD8+亚群比例（P＜0.05）。［结论］通过提高T淋巴细胞及其CD4+亚群相对数量，使CD4+/CD8+比例接近正常值，此可能是余甘子叶提取物抗肿瘤的免疫学机制之一。

关键词：余甘子叶提取物；荷瘤小鼠；CD3+；CD4+；CD8+

余甘子叶来源于大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica L.，近年来研究报道余甘子叶具有抗肿瘤［1-2］、增强免疫［3］、抗菌［4］、抗炎［5］等广泛的药理作用。本研究进一步观察余甘子叶提取物对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响，为明确其抗肿瘤免疫机制提供科学依据。

1　实验材料

1.1受试药物余甘子叶提取物（PL）:将余甘子叶晒干，打碎成最粗粉，加乙醇渗漉提取得渗滤液，再减压蒸馏得到干浸膏，最后加入乙酸乙酯萃取得到PL。以芦丁为对照品，经高效液相色谱法测定PL总黄酮含量为50%。本实验所用PL由广西中医药大学新药研究开发中心制备。

1.2细胞株小鼠肝癌细胞株（H22），取自广西中医药研究院。1.3动物昆明种小鼠，SPF级，购于广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号:SCXK桂2009-0002。

1.4试剂HANK’S Balanced Salt Mixture（北京索莱宝科技有限公司，规格:每瓶500 ml；批号:20140810）；小鼠外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司，规格:每瓶100 ml；批号:20140719）；氯化钠注射液（上海信谊金朱药业有限公司，规格:每支10 ml；批号:140829）；FITC Hamster Antimouse CD3e（美国BD公司，规格:0.5 mg/ml；批号:4216765）；PE-CYTM7Ratanti-mouseCD4（美国BD公司，规格:0.2mg/ml；批号:3247509）；PE Rat anti-mouse CD8a（美国BD公司，规格:0.2 mg/ml；批号:3276860）。

1.5仪器3210型单道可调移液器（德国Eppendorf公司）；明澈TM-D超纯水仪（美国Millipore公司）；ST16R型离心机（Thermo Fisher公司）；AL104型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；EL-620J型电子天平（常州市天之平仪器设备有限公司）；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YXQ-LS-50-SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限医疗设备厂）；Primovert型倒置式显微镜（德国ZEISS公司）；LSR Fortessa型流式细胞分析仪（美国BD公司）。

2　方法与结果

2.1造模与给药50只昆明小鼠，雌雄各半，分为5组，分别为空白对照组、模型对照组和PL高、中、低剂量组（1.982，0.991，0.496 g/kg）。除空白对照组外，其余4组小鼠均在右前肢腋窝皮下注射H22细胞悬液（浓度为2×107/ml，每只0.2 ml）造成H22荷瘤小鼠模型。造模后24 h各组开始每日灌胃给药1次（20 ml/kg），空白对照组和模型对照组同时给予等量蒸馏水，连续给药7 d。

2.2指标检测末次给药后1 h，各组小鼠用平口毛细管从眼眶后静脉丛采血20滴/只（EDTA-2Na抗凝），按1∶1比例加入HANK’S Balanced Salt Mixture稀释血液，再将其缓缓倾斜加至盛有小鼠淋巴细胞分离液的15 ml离心管中，保持界面清晰，4℃离心（800 g）20 min后吸出中间层的白色淋巴细胞，移至另一支15 ml离心管内，每管加入10 ml PBS，重悬，4℃离心（400 g）20 min后弃去上清液，再加入2 ml PBS，重悬，4℃离心（300 g）5 min后弃去上清液，加适量PBS重悬，取20 μl加于血细胞计数板上计数，调整细胞浓度为1.0×108/ml，之后加表面抗体（FITC Hamster Anti-mouse CD3e，PE-CYTM7 Rat anti-mouse CD4，PE Rat anti-mouse CD8a）混匀，4℃冰箱避光孵育30 min，每管加入1ml PBS，混匀，4℃离心（300 g）5 min，吸取上清液，加入500 μl 1%多聚甲醛，200目过滤后流式细胞仪检测。

2.3统计学处理应用SPSS 19.0 for Windows进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，各组均数之间进行one-way ANOVA比较检验，以P＜0.05为有显著性差异。

2.4对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响见表1。

表1　PL对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响（±s，n=10）

表1　PL对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响（±s，n=10）

注:与空白对照组比较，①P＜0.05；与模型对照组比较，②P＜0.05

CD4+/CD8+（%）空白对照组—　55.1±1.9　32.3±3.7　22.3±3.0　1.50±0.36模型对照组—　52.0±3.1①　28.3±4.4①　23.6±3.4　1.21±0.2①PL高剂量组　1.982　54.8±2.6②　32.1±3.6②　22.3±2.9　1.48±0.33②PL中剂量组　0.991　55.0±2.4②　31.8±2.3②　22.5±2.7　1.44±0.27②PL低剂量组　0.496　51.7±4.2　30.3±5.6　21.8±5.9　1.51±0.5组别剂量（g/kg）T淋巴细胞（%）CD4+亚群（%）CD8+亚群（%）

结果表明，与空白对照组比较，荷瘤小鼠外周血中T淋巴细胞（CD3+）及其CD4+亚群相对数量显著降低（P＜0.05），T淋巴细胞CD4+/CD8+比例显著降低（P＜0.05）；在灌胃给予PL高、中剂量（1.982，0.991 g/kg）干预后，模型小鼠外周血中T淋巴细胞（CD3+）、T淋巴细胞CD4+亚群相对数量显著提高（P＜0.05）；T淋巴细胞CD4+/CD8+比例显著提高（P＜0.05），并接近正常小鼠水平，与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

3　讨论

现代医学研究表明，机体组织细胞的凋亡、代谢及疾病的发生发展都与机体免疫系统的功能密切有关，若机体的免疫功能不能对细胞的凋亡进行调控，相应组织器官就会发生病变，如艾滋病、肿瘤等疾病均为机体免疫系统失调导致免疫功能低下所致。T淋巴细胞是构成机体免疫防御系统的重要细胞，在肿瘤的发生、发展和判断治疗效果及预后的过程发挥着重要的作用，CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴细胞细胞膜上的分化抗原簇，CD3+为所有T细胞的特有标志，CD4+为辅助性T细胞的标志，CD8+为细胞毒性T细胞的标志。其中CD4+T淋巴细胞能通过辅助B细胞产生抗体、分泌细胞因子，促进效应细胞抗肿瘤作用，CD8+T淋巴细胞则主要是相反的免疫抑制作用［6］，因此通过检测T淋巴细胞及其亚群可以有效地了解肿瘤的发生和发展及药物的抗肿瘤疗效。

本课题组前期实验结果表明，PL对荷瘤小鼠表现出较好的抗肿瘤效果及免疫调节作用［1］。为进一步完善其抗肿瘤免疫机制，本试验在此基础上观察了PL对荷瘤小鼠T淋巴细胞CD4+、CD8+亚群的影响。实验结果表明，荷瘤小鼠经PL高、中剂量（1.982，0.991 g/kg）灌胃给药干预后，外周血中T淋巴细胞及其CD4+亚群、CD4+/CD8+数量显著提高，并接近正常小鼠水平。结果提示，余甘子叶提取物能提高T淋巴细胞及其CD4+亚群相对数量，使T淋巴细胞CD4+/CD8+比例接近正常值，由此推测，该作用可能是其抗肿瘤的免疫学机制之一。

参考文献

［1］黄燕，罗雪菲，李舒，等.余甘子叶提取物对荷瘤小鼠抑瘤及免疫功能影响的研究［J］.时珍国医国药，2011，22（9）: 2204-2206.

［2］曾春兰，钟振国.余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究［J］.时珍国医国药，2008，19（3）:580-583.

［3］钟振国，罗雪菲，黄金兰，等.余甘子叶提取物对小鼠免疫功能的影响研究［J］.中药材，2013，36（3）:441-444.

［4］钟振国，曾春兰.余甘子叶提取物体外抗菌实验研究［J］.中药材，2008，31（3）:428-431.

［5］李宗友.余甘子叶提取物的抗炎作用［J］.国外医学:中医中药分册，1998，20（4）:52.

［6］金从国，王熙才，伍治平，等.癌症患者外周血T细胞亚群水平及临床意义［J］.肿瘤研究与临床，2003，15（1）:33-34.

（编辑陈明伟）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：2095-4441（2015）02-0004-03

收稿日期:2015-02-27

基金项目:广西中药药效研究重点实验室（省级）开发课题（编号:051-06-K6）；广西中医药大学自然科学研究项目（编号: YB14001）

作者简介:罗雪菲（1981-），女，汉族，医师，硕士，研究方向:临床输血检验教学与科研

通信作者:兰太进，E-mail:lantj0302@yahoo.com.cn

The Effect of Extract of Phyllanthus Emblica Leaves（PL）on CD4+and CD8+in Peripheral T-cell lymphocyte of Tumor-bearing Mice

LUO Xue-fei1，GU Guo-long1，LAN Tai-jin2
（1.Ruikang hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530011；2.College of Preclinical Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001）

Abstract:［Objective］ToobservetheeffectofextractinPLonCD4+and CD8+in peripheral T-cell lymphocyte of tumor-bearing mice. ［Methods］H22mice tumor-bearing model was established and treated with PL of high，medium and low dose（1.982，0.991，0.496 g/kg）by intragastric administration.The effect of PL on CD4+and CD8+in peripheral T-cell lymphocyte of tumor-bearing mice was observed. ［Results］The extract in PL of high and medium doses（1.982，0.991 g/kg）could significantly improve the relative quantity of T lymphocyte and CD4+T lymphocyte of tumor-bearing mice（P＜0.05）and up-regulated the proportion of CD4+and CD8+（P＜0.05）. ［Conclusion］Improving the quantity of T lymphocyte and CD4+T lymphocyte of tumor-bearing mice can make the proportion of CD4+/ CD8+T lymphocyte close to normal value.That is one of the anti-tumor immunological mechanisms of PL extract.

Keywords:Extract of Phyllanthus Emblica Leaves（PL）；Tumor-bearing Mice；CD3+；CD4+；CD8+