丙冬甘宁中药发酵用微生物及发酵条件的筛选

范作良　鞠 雷　李汝春　陈风梅　（山东畜牧兽医职业学院　山东 潍坊　261061）贾慧卿　（潍坊诺达药业有限公司　山东 青州）

丙冬甘宁中药发酵用微生物及发酵条件的筛选

范作良鞠 雷李汝春陈风梅（山东畜牧兽医职业学院山东 潍坊261061）
贾慧卿（潍坊诺达药业有限公司山东 青州）

摘要本研究筛选出最佳发酵菌为枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌的发酵受碳源、氮源、温度、接种量、发酵时间、培养基的ph值等多种因素的影响，通过单因素实验发现pH值对芽孢杆菌的发酵影响显著，应采取控制pH在6.0左右；发酵时间达到一个定值之后，芽孢杆菌的数量不会随着发酵时间的延长增加而增加，因此在生产中采取的发酵时间为52h；芽孢杆菌发酵的最适温度在32～37℃时，芽孢杆菌的浓度变化不大，根据生产的需要，采取35～37℃。

关键词中药发酵微生物筛选

肝脏作为动物体内重要而具有特殊功能的代谢器官，对体内的代谢、消化、排泄、解毒以及免疫等过程具有重要作用。病毒、代谢毒物、药物、各种理化因素等均可导致肝脏损伤或者肝功能障碍，动物肝脏疾病的防治已经成为当前人们关注的热点之一［1］。近年来，由于各种因素导致肝脏疾病的频发，给养殖户带来了巨大的经济损失。栀子、甘草、柴胡、五味子、丹参等中药作为保肝药物已经有很长的应用历史［2-6］，将这几味药组方为丙冬甘宁，本文利用有益菌将丙冬甘宁提取物进行发酵处理，筛选最优的有益菌及发酵条件，达到提高药效的目的。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、布拉酵母菌上述菌种均购自重庆力克生物有限公司，经鉴定为有活力的生物菌种。

1.1.2中药提取液由潍坊诺达药业有限公司提供。

1.1.3培养基芽孢杆菌种子培养基：牛肉膏5g、大豆蛋白胨10g、氯化钠5g、水1L、pH值7.0、0.1MPa灭菌

20min。酵母菌种子培养基（g/L）：葡萄糖15，酵母5，MgSO4·7H2O 0.25，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5。基础培养基：葡萄糖20g、硫酸铵7g、水1L，KH2PO40.5g、pH值7.0、0.1MPa灭菌20min。

1.2方法

1.2.1发酵用菌种（1）种子液的制备：分别将芽孢杆菌和酵母菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，于37℃培养18h。取培养好的斜面，用接种环挑1环接种于，盛有50ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中，然后置回转式恒温调速摇瓶柜中，3 7℃振荡培养2 4h，转速为120r/min。（2）摇瓶培养：分别取种子液，超净工作台上接入盛有50ml无菌种子培养基的250ml三角瓶中，接种量为10%（V/V）。置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，37℃培养30h，培养结束取样测定活菌数。活菌计数方法：采用倾注法按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从3 种合适的稀释液中分别吸取0.2ml置于无菌培养皿中，每一稀释度做3个平皿。将事先融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基，向每个培养皿中倒入约10ml摇匀，待凝固后，37℃倒置培养进行菌落计数。通过菌落计数发现，种子液中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌，布拉酵母菌的菌落数分别为8.7×107/ml，9.1×107/ml，6.4×107/ml，5.2×107/ml。（3）中药发酵培养基的配置：将制得的中药提取液中代替基础培养基中的水，并加入尿素，并调节pH至6.0制成中药基础培养基。葡萄糖20g，硫酸铵8g，中药提取液1L，KH2PO40.5g，NaHCO3适量。（4）菌种筛选：分别将制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母菌，布拉酵母菌接种到中药基础培养基中，接种量为10%（V/V）。置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，37℃培养30h。培养结束取样测定活菌数。1.2.2单因素试验设计筛选发酵条件通过单因素试验改变发酵条件，寻找相关因素对芽孢杆菌在中药基础培养基中发酵的影响，单因素试验设计表如表1所示。按照每一个因素分别进行实验研究。

表1　单因素不同水平试验设计表

2　结果

2.1确定发酵用菌种

测定发酵液中的活菌数，结果如表2。

表2　不同菌种在中药发酵培养基中活菌数　　（×107/ml）

通过比较发现芽孢杆菌能够在中药发酵液中正常生长，并不断增值，而酵母菌不能在中药发酵液中增值，因此确定以芽孢杆菌作为菌种。

2.2芽孢杆菌的发酵效率

通过比较发现枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵效率相差不大，都能够在中药发酵液中长期生长繁殖，因此，研究了不同比例的芽孢杆菌对在中药基础培养基中的产率，接种浓度均为10%，结果如表3。

表3　不同比例的芽孢杆菌发酵效率（枯草：地衣）　　　（%）

通过结果可以看出，不同比例的芽孢杆菌发酵后，产生的芽孢杆菌的数量差异不显著（P＞0.05），由于不同的产孢杆菌产生的酶及对中药的代谢，产生的次生代谢产物不同，因此，采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的比例为1:1的混合菌种作为种子液发酵。

2.3葡萄糖浓度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照单因素实验设计表中葡萄糖的含量配置不同葡萄糖浓度的基础培养基，其他条件为：硫酸铵8g，中药提取液1L，KH2PO4 0.5g，用适量NaHCO3调节pH值到6.0，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量为10%（v/v），置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察碳源对芽孢杆菌发酵的影响，结果如图1。培养基中葡萄糖的浓度在10～15g/L之间时，就能满足自身的需要，当葡萄糖的浓度高于15g/L时，芽孢杆菌的发酵不会随着糖浓度的升高，芽孢杆菌继续发酵，此时，多余的糖分将溶解在发酵液中，芽孢杆菌产生分解产生的碳源能够满足自身的需求。

图1　葡萄糖浓度对芽孢杆菌发酵的影响

图2　硫酸铵浓度对芽孢杆菌发酵的影响

2.4硫酸铵浓度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照单因素实验设计表中硫酸铵的含量配置不同硫酸铵浓度的基础培养基，其他条件为：葡萄糖20g、中药提取液1L、KH2PO40.5g，用适量NaHCO3调节pH值到6.0，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量为10%（v/v），置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察氮源对芽孢杆菌发酵的影响，结果如图2。当硫酸铵的浓度6g/L时，芽孢杆菌的生长曲线，将不会继续上升，硫酸铵的浓度在8g/L时，芽孢杆菌的浓度与6g/L相差不明显，但是当硫酸铵的浓度为4g/L时，芽孢杆菌的浓度将显著低于6g/L，因此，可以推断培养基中硫酸铵的浓度最佳在6g/L左右。

2.5pH值对芽孢杆菌浓度变化的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照单因素实验设计表中发酵液的pH值配置不同酸度浓度的基础培养基，其他条件为：葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g，用适量NaHCO3和盐酸调节pH值，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量为10%（v/v），置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，37℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察pH值对芽孢杆菌发酵的影响，结果如图3。当ph值有小的变动时，发酵液中芽孢杆菌的浓度也会伴随着较大的变动，从实验结果来看，芽孢杆菌的最佳pH值为6.0。

2.5温度对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g，用适量NaHCO3调节发酵基质的pH值为6.0，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量为10%（v/v），置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，分别在24、28、32、37℃，42℃培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察温度对芽孢杆菌发酵的影响，结果如图4。随着温度的升高，发酵液中芽孢杆菌的数量不断增加，当温度在32～37℃芽孢杆菌的数量达到最高值，当发酵温度是42℃时，发酵液中的芽孢杆菌浓度呈现下降趋势，说明温度升高，芽孢杆菌将停止生长，形成芽孢度过温度不适的阶段。因此，芽孢杆菌发酵的温度控制在32～37℃之间。

温度（℃）

2.6接种量对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g，用适量NaHCO3调节发酵基质的pH值为6.0，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量按照表2～3设置的浓度分别接种为10%，置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，分别在37℃，培养36h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察接种量对芽孢杆菌发酵的影响，结果如图5。发酵液中芽孢杆菌的数量随着接种量的增加而增加，5%～10%之间时，芽孢杆菌的数量相差不大，从图可以看出发酵液的最佳接种量在8%左右，当接种量大于10%，会造成部分菌种的浪费，低于5%，芽孢杆菌发酵不充分，其中的部分营养物质不能得到利用。

2.7发酵时间对芽孢杆菌发酵的影响

将5个锥形瓶清洗干净，灭菌后，按照葡萄糖20g、硫酸铵8.0g、中药提取液1L、KH2PO40.5g，用适量NaHCO3调节发酵基质的pH值为6.0，每个锥形瓶中加入基础培养基50ml，接种量按照表2～3设置的浓度分别接种为10%，置回转式恒温调速摇瓶柜中振荡培养，转速为120r/min，分别在37℃培养28、36、44、52、60h。以发酵液中芽孢杆菌的数量作为考察指标，来考察发酵时间对芽孢杆菌发酵效果的影响，结果如图6。发酵时间与芽孢杆菌的浓度可以看出，随着发酵时间的延长，发酵液中芽孢杆菌的数量会继续增加，发酵时间达到52h后，发酵液中芽孢杆菌的数量不再随着时间的延长继续增加，因此，最佳的发酵时间为52h。

图5　接种量对芽孢杆菌发酵的影响

图6　发酵时间对芽孢杆菌在中药发酵基质中发酵的影响

3　结论

不同比例的芽孢杆菌发酵后，产生的芽孢杆菌的数量差异不显著（P＞0.05），由于不同的产孢杆菌产生的酶及对中药的代谢，产生的次生代谢产物不同，因此，采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的比例为1:1的混合菌种作为种子液发酵。

芽孢杆菌的发酵受碳源，氮源，温度，接种量，发酵时间，培养基的ph值等多种因素的影响，通过实验发现培养基中葡萄糖的浓度在10～15g/L、硫酸铵的浓度在6g/L、pH值6.0、温度32～37℃、发酵液的接种量在8%左右、发酵时间52h为最佳。

参考文献

［1］ 王丽宏， 吉红， 张宝彤等. 中草药保肝作用的研究进展［J］. 饲料博览， 2012，11:41-45.

［2］ 胡元亮. 中兽医学［M］. 北京: 中国农业出版社， 2006.

［3］ 刘钟杰， 许剑琴. 中兽医学［M］. 北京: 中国农业出版社， 2010.

［4］ 钟秀会， 刘占民. 兽医中药学［M］. 北京: 中国农业出版社， 2009.

［5］ 汪德刚. 兽医中药学［M］. 北京: 中国农业大学出版社， 2008.

［6］ 李时珍. 本草纲目［M］. 医药学， 1590.

中图分类号：S816.76

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）04-0003-03

收稿日期：（2015-01-13）