奶牛肠道致病性沙门氏菌的分离与鉴定

周进文

(黑龙江省大西江农场畜牧科,黑龙江黑河 161448)

奶牛肠道致病性沙门氏菌的分离与鉴定

周进文

(黑龙江省大西江农场畜牧科,黑龙江黑河 161448)

奶牛沙门氏菌病是指奶牛受到沙门氏菌属细菌所感染而导致奶牛受到传染而发生疾病。常见的奶牛受到沙门氏菌感染后所引起的症状有:奶牛败血症、奶牛胃肠炎以及怀孕母牛发生流产等等。本试验为调查研究黑龙江省九三管理局某牛场沙门氏菌的流行情况,对黑龙江省九三管理局某奶牛场出现疑似症状的奶牛进行采取肠道新鲜粪便进行了致病性沙门氏菌的分离与鉴定。

奶牛沙门氏菌病;沙门氏菌属细菌;分离

1 材料与方法

1.1 材料

粪样：取自黑龙江省九三管理局某奶牛场疑似感染沙门氏菌的荷斯坦泌乳奶牛的直肠粪便。

培养基：DHL 琼脂、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、营养肉汤、SS 琼脂、三糖铁培养基。

革兰氏染色试剂：草酸铵结晶紫染色液；革兰氏碘液；沙黄水溶液；碳酸品红溶液。

1.2 方法

粪样的采集：从试验牛的肛门采集直肠粪样，将采集的新鲜粪样分别装入无菌三角瓶立即送实验室。

致病菌培养：

预增菌培养：无菌称取样品 25.0g，加入蛋白胨水225ml，于37℃培养箱当中培养18 h。

选择性增菌培养：取预增菌0.1ml，接种含有 10 ml MeCl2—MM的培养管当中，培养温度设置为42 ℃，培养时间为 24 h；另外选取预增菌培养物 10ml，接种于含有 100ml SC培养管当中，于37℃培养箱当中培养 1～2d。

纯化培养：取（MM）和（SC）增菌液，分别划线接种于DHL 琼脂平板上，于37℃培养箱当中培养 18h～24h，选取单克隆菌种，纯化培养。纯化的可疑菌落接种普通琼脂斜面，置于37℃培养箱当中培养 18 ～24 h，于4℃冰箱当中保存备用。

致病菌的鉴定：

镜检：从 DHL 琼脂平皿培养物上挑取单个可疑菌落，涂片、革兰氏染色，镜检。

生化鉴定：纯培养后的菌株接种于普通肉汤中 37℃培养18h～24 h 后，吸取 1～2 滴的肉汤培养物加入各种微量生化管内，37℃培养 24h～48h，观察结果。

血清型鉴定：采用玻片凝集法。在玻片上用少量生理盐水稀释普通营养琼脂平板上的纯化菌落至悬液呈均匀的乳白色，首先滴加 1 滴沙门氏菌 A－F 多价血清与之混合均匀，观察结果；然后，用各群 O 抗原因子血清，即 O2（A 群）、O4（B 群）、O7（C1 亚群）、O8（C1 亚群）、O9（D4 群）、O5，O10（E群）、O11（F 群）对被检菌逐个进行凝集试验检查，确定其 O抗原组成。同时，以标菌株做阳性对照、灭菌生理盐水代替多价血清做阴性对照，实验方法同上。

2 结果与分析

2.1 分离细菌培养特性

分离的细菌于37℃培养箱当中培养24 h后发现，当使用普通营养肉汤时，出现浑浊且有少量的沉淀出现。

于常规普通的营养琼脂上培养发现，长势良好，菌种形态为：略微凸起、表面光滑、呈圆形；颜色为：半透明，或者呈现出灰白色；菌种之间排列较为紧密，而且大小均匀。

将分离的菌株培养于 SS 琼脂后发现，菌落形态为：菌落性状均一，呈圆形状态，略微凸起，菌落中央呈现出黑色

将分离得到的菌种培养于 DHL 琼脂平板上进行培养发现：菌落状态为：无色半透明，产生H2S菌落的中心呈现为黑色；而乳糖呈现阳性的菌株的颜色呈现为：粉红色，且带有黑色；将其进一步接种 TSI 斜面，产生如表 1结果的菌落判为疑似菌，传代纯化后进一步做生化鉴定和血清型鉴定。

表1 沙门氏菌三糖铁（TSl）培养基生长判断标准

2.2 形态学特性

涂片、革兰氏染色镜检为两端钝圆、革兰氏阴性短小杆菌。如图1

图1 沙门氏菌革兰氏染色

2.3 生化鉴定结果

将分离得到的菌株置于生化管当中于37℃培养箱进行培养，培养时间为 1～2 d，观察，并记录结果。三糖铁斜面的颜色为红色，底部呈黄色略变黑。沙门氏生化鉴定结果：H2S、丙二酸盐为大多数菌株阳性/少数阴性；靛基质、尿素、KCN、水杨素、吲哚、ONPG为阴性；赖氨酸脱羧酶、山梨醇、甘露醇、卫矛醇、木糖、硝酸盐、葡萄糖、枸橼酸盐均为阳性；

2.4 血清型鉴定

所采取样品进行培养之后的培养液与用于鉴定的血清在2分钟内发生凝集即为阳性，相反则为阴性。各群中 B 群沙门氏菌最为普遍，占 50.0%（4/8），其次为 D 群沙门氏菌、C1 群沙门氏菌、A 群沙门氏菌，各占 12.5%（1/8）、25%（2/8）、12.5%（1/8）

3 讨论

对疑似沙门氏菌的菌种进行血清型鉴定实验，实验结果表明：在同一个牛场当中所感染的沙门氏菌得血清型就有多种，说明沙门氏菌血清型的复杂性。此外，对沙门氏菌研究较为普遍的报道一般以牛流产沙门氏菌的分离鉴定为主。因此，调查该地区牛场当中沙门氏菌的血清型以及流行情况，不但为牛场沙门氏菌病的防制，提供了理论基础以及科学依据，此外该措施无疑将为控制沙门氏菌污染食品奠定良好的实验基础。

本试验对疑似感染沙门氏菌的奶牛进行采样分析，对其直肠内粪便内菌群进行分离鉴定，对所分离出的菌种的形态特征、染色结果、培养特性、三糖铁琼脂板上的生长形态特征，从九三管局某牛场当中出现疑似感染沙门氏菌共 4 头成年泌乳荷斯坦奶牛直肠新鲜粪便中初步分离到 4 株沙门氏菌。通过观察这几株菌落的生长状态、生化试验、血清型鉴定等试验。试验结果表明，4 株沙门氏菌为致病性沙门氏菌，其血清型有A 群、B 群、C1亚群、D4 群。而奶牛在受到沙门氏菌感染时，主要的致病性沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌以及都柏林沙门氏杆菌。奶牛在被沙门氏菌所感染之后通常表现出胃肠炎、败血症、怀孕母牛发生流产等症状。为此，在畜牧业的生产实践中对牛舌环境质量的控制无疑将成为首要任务，同时更应该要高度注意奶牛的环境卫生，并采用综合性疾病防治措施，此举，无疑对保障畜牧业的发展以及畜牧经济动物健康具有重要的意义。

[1] 吴美云.奶牛肠道沙门氏菌的分离鉴定、对机体内分泌的影响和体外抑制研究[D].内蒙古农业大学，2009.