超快速高效液相色谱法测定普通白菜中16种氨基甲酸酯类农药残留

万凯　刘家容　陆莹　杨炜君

摘 要 研究应用超快速高效液相色谱仪柱后衍生荧光检测器同时测定普通白菜中16种氨基甲酸酯类农药残留。对流动相组成、波长选择、梯度洗脱等条件进行比较研究，建立了样品经乙腈提取，SPE-NH2固相萃取柱净化，液相色谱柱后衍生分离，荧光检测（λex=339 nm， λem=445 nm）测定，外标法定量的检测方法。研究表明：基于液相色谱荧光检测条件，16种农药残留在0.025～1.0 mg/L浓度范围内线性关系良好；检出限0.002～0.010 mg/L；平均加标回收率73.0%～103.0%，相对标准偏差（RSD）1.5%～8.8%。该研究确定的方法具有检测范围广、快速、灵敏、准确、重现性好、易推广等特点。

关键词 超快速高效液相色谱法 ；荧光检测 ；氨基甲酸酯 ；农药残留

分类号 S481.8

Abstract The study aims to establish a method for simultaneous determination of 16 pesticide residues which are Aldicarb-sulfoxide， Aldicarb-sulfone， oxamyl， Methomyl， Hydroxycarbofuran， toxic metabolite， Aldicarb， Tsumacide， Propoxu， Carbofuran， Carbary， XMC， Isoprocarb， Fenobcarb， Methiocarb， Thiodicarb， Promecarb in cabbage by ultra fast high performance liquid chromatograph column derivative fluorescence detector. Meanwhile， the study also aims to the comparison of the composition of mobile phase， wavelength selection， gradient elution at different levels. Samples were ectracted by acetonitrile and purified by SPE-NH2-dispersive solid phase extraction. The colleted solution was analyzed by UFLC-FLD with post-column derivation and quantified by external standard method. The wavelengths were set at 339 nm and 445 nm. The result indicates that the calibration curves of 16 pesticides showed good linear relationship in the concentration of 0.025～1.0 mg/ L with correlation coefficients greater than 0.999. The detection limits ranged from 0.002～0.010 mg/L. The recoveries ranged from 73.0%～103.0% with the relative standard deviation （RSD） range of 1.5%～8.8% . The method is characterized as wide range of detection， rapid， sensitive， accurate， repeatable and ease of deployment.

Keywords ultra fast high performance liquid chromatography （UFLC） ； fluorescence detector （FLD） ； carbamate pesticides ； pesticide residues

自20世纪70年代以来，由于氨基甲酸酯类杀虫剂具有广谱、高效的特点，在我国使用越来越普遍[1-3]，它是一类具有-NH（CO）O-官能团有机化合物的统称，是氨基甲酸（NHaCOOH）的酯类，毒理机制是抑制昆虫乙酰胆碱酶和羧酸酯酶的活性，造成乙酰胆碱和羧酸酯的积累，影响昆虫正常的神经传导而致死，它是针对有机氯和有机农药的不足而开发的一类新型农药，被广泛地应用于粮食、蔬菜水果及经济作物的害虫防治[4-5]。氨基甲酸酯类农药除了杀虫作用之外，还有显著刺激作物生长的作用，其缺点是毒性大，易发生人、畜中毒事件，其残留对人，畜及环境可产生极大的危害。目前，氨基甲酸酯类农药的残留分析已倍受关注。

目前，氨基甲酸酯类农药残留检测方法很多，有色谱法[6-8]、生物检测法[9]、生物传感器法[10]、免疫分析法[4]、化学计量学分析法[11]等。色谱法应用最为广泛，其中以液相色谱质谱联用仪和液相色谱仪柱后衍生检测应用最为普遍。液质联用技术具有检测灵敏度高、选择性好的优点，其缺点是设备价格高昂，对检测条件要求较高，普通实验室难以达到要求，难推广。目前常用的液相色谱法可以高效、快速地测定氨基甲酸酯类农药残留量，但存在分析时间长、检测项目参数少的问题，如邵金良等[12-13]用液相色谱法完成7～10种氨基甲酸酯农药残留时间接近30 min；毛秀红等[14]用13种氨基甲酸酯测定方法时间在50 min以上；张帆等[15]的液相质谱联用法完成20种氨基甲酸酯农药残留测定时间也要22 min。本研究主要基于液相色谱柱后衍生荧光检测条件，探索同时测定16种氨基甲酸酯类农药残留的快速方法，为食品农产品相关农药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

Shimadzu 氨基甲酸酯柱后衍生系统（具体配置为：输液泵LC-30AD×2和LC-20AD×2，脱气机DGU-20A5R，自动进样器SIL-30AC，检测器RF-20Axs，柱温箱CTO-20A，化学反应箱CRB-6A，控制器CBM-20A，工作站LC-Solution）；高速匀浆机（IKA， T18 basic）；离心机（Allegra X-15R）；氮吹仪；固相萃取装置（美国Supelco公司）。

1.1.2 试剂

16种氨基甲酸酯类农药标准品中残杀威、甲硫威、灭除威、猛杀威购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，其余农药标准品均来自于农业部环境质量监督检验测试中心（天津），纯度大于99%。

乙腈、甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃均为色谱纯（Merk， Germany）； NaOH（特级，Wako公司），硼酸（Boric Acid）（特级，Wako公司），邻苯二甲醛（O-Phthaladehyde，OPA）（色谱级，PICKERING），β-巯基丙酸（β-Mercaptopropionic acid）（纯度：97%以上，株式会社同仁化学研究所）；SPE-NH2固相萃取小柱（500 mg/6 mL，岛津技迩公司）；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

标准溶液：准确量取适量的上述16种标准品，用甲醇配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液，避光冷冻保存。用空白样品基质逐级稀释到0.025、0.050、0.10、0.500和1.00 mg/L系列的浓度，留作标准曲线用。

一级反应试剂：称取1.0 g 氢氧化钠，溶于500 mL 水中；二级衍生试剂：称取15 mg 邻苯二甲醛（OPA），溶于50 mL 甲醇中，得到A 液；称取3.34 g 硼酸和0.18 g 氢氧化钠，溶于400 mL 纯水中，得到B液；将A 液和B 液混合，过滤，脱气后加入11 μL 2-巯基丙酸，混合，使用当天配制。所有试剂和样品需用0.45 μm 以下滤膜过滤。

1.2 方法

1.2.1 提取与净化

15 g样品加入30 mL乙腈提取，高速匀浆机匀浆2 min，加入2 g氯化钠和3 g无水硫酸镁，漩涡混匀1 min，3 500 r/min离心5 min，取上清液5 mL，氮吹至近干。先用5 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液预淋洗固相萃取小柱，加入2 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液溶解残渣，上样，再用10 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液分2次洗脱，收集洗脱液，氮吹至干。加入甲醇定容至2.5 mL，过0.22 μm滤膜后供超高效液相色谱仪测定。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS 75 mmL×4.6 mm I.D.，2.2 μm；流动相：A 相-水（含0.2%四氢呋喃），B 相-甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：50℃；进样量：2 μL；波长：Ex=339 nm，Em=445 nm ；一级反应温度100℃，流速：0.5 mL/min；二级衍生温度50℃，流速：0.5 mL/min。梯度洗脱条件见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

基于液相色谱要实现对16种氨基甲酸酯类农药的分离检测，不同农药种类间完全分离是本研究的重点，在综合考虑16种农药的极性特点，针对流动相组成、梯度洗脱条件、检测波长等因素进行研究，以确定适合、经济、友好、易推广的条件。

2.1.1 流动相的组成

目前使用高效液相色谱-柱后衍生法测定氨基甲酸酯类农药的流动相主要有甲醇-水体系[16]、乙腈-水体系[12]、乙腈-甲醇-水体系[17]3种。探索应用本试验所选择的色谱柱，通过不断调整梯度洗脱条件，应用甲醇-水体系作为流动相，最好的效果是实现了14种农药标准品的分离，其中残杀威与克百威无法完全分离（图1）；应用乙腈-水流动相体系时，由于乙腈极性大，分离效果更差，其中杀线威与灭多威、残杀威与克百威均不能完全分离；应用乙腈-甲醇-水流动相体系，同样无法使得残杀威与克百威完全分离。研究表明，上述3种流动相体系中以甲醇-水体系分离效果最佳。进一步以甲醇-水体系作为流动相研究，在水中添加0.2%的四氢呋喃，可实现16种农药标准品完全分离，且能够缩短出峰时间。根据分离情况，对流动相的洗脱条件稍作调整，最终采用甲醇-四氢呋喃水溶液体系作为流动相进行梯度洗脱，在25 min内实现16种目标成分完全分离（图2、3），比现行农业行业标准NY/T 761中推荐的10种氨基甲酸酯类农药测定时间短，提高了检测效率，节省试验试剂。

2.1.2 检测波长的选择

目前使用液相色谱荧光检测器测定氨基甲酸酯类农药主要有4种选择，分别是检测波长：Ex=339 nm，Em=445 nm[17-18]；Ex=330 nm，Em=465 nm[14，16，19] ；Ex=260 nm，Em=465 nm；Ex=230/330 nm，Em=425 nm。图4为16种氨基甲酸酯类农药在不同检测波长条件下的色谱图，综合比较了以上不同检测波长条件下目标分析物的响应情况，发现在Ex=339 nm，Em=445 nm和 Ex=330 nm，Em=465 nm波长下，16种农药响应值相对较高，检测灵敏度更高，更适于痕量残留的检测；在Ex=330 nm，Em=425 nm波长下，响应值较低；在Ex=260 nm，Em=465 nm和Ex=230 nm，Em=425 nm检测波长下，响应值最低。最终选择Ex=339 nm，Em=445 nm作为本实验的检测波长。

2.2 线性范围和检出限

在上述研究设定的色谱条件下，对浓度为0.025、0.050、0.10、0. 500和1.00 mg/L的标准系列溶液进行测定，建立标准曲线，在各自线性范围内，它们的相关系数（r2）均大于0.999。根据3倍信噪比（S/N）确定16种农药的检出限（LOD），16种农药的线性关系、相关系数以及检出限等结果见表2。

2.3 准确度和精密度

以不含目标化合物的普通白菜样品为本底，分别添加3个水平（添加浓度分别为0.05、0.10及0.20 mg/L）的16种农药混合标准溶液，按照上述实验方法进添加回收试验，重复进行6次实验，得出各农药的平均回收率和相对标准偏差，见表3。结果表明，16种氨基甲酸酯类农药的回收率在73%～103%，相对标准偏差为1.5%～8.8%，满足农药残留分析的要求。

3 讨论

目前在农产品中农药残留检测常用到农业行业标准 NY/T 761-2008，推荐测定氨基甲酸酯类农药残留使用的是液相色谱柱后衍生荧光法，测定10种农药分析时间为26 min，且流动相中甲醇比例变动幅度大，对于批量样品检测需要较长的平衡时间。经典的QuEChERS法，由于前处理方法的主要优势是简单快速，还无法做到基质的完全净化，因此在与各种精密高端检测仪器联用进行痕量或超痕量分析时，容易产生基质效应，影响检测结果的准确度与可靠性，且仪器设备昂贵。本研究建立的普通白菜中16种氨基甲酸酯类农药残留量的超快速高效液相色谱检测法，实现了25 min内实现16种氨基甲酸酯类农药测定，相对于NY/T761分析时间更短，甲醇用量少，甲醇比例变动幅度不超过45%，批量样品检测需平衡时间短，节省分析时间。与此同时，具有满意的分离效果和检测灵敏度、回收率、精密度和定量限满足农药残留分析的要求，测定重现性良好，具有检测快速、检测项目多、仪器设备要求不高，易在普通实验室推广的特点，能满足日常检测需求，为基层检测机构氨基甲酸酯类农药的检测提供借鉴和参考。

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