响应法优化南瓜中色素的提取工艺研究

于开源，鞠晓峰，郑丽娜，孙清瑞，刘志明，李秀波

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

响应法优化南瓜中色素的提取工艺研究

于开源1，鞠晓峰2，郑丽娜1，孙清瑞1，刘志明1，李秀波1

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

以南瓜为原料，利用复合溶剂萃取南瓜中色素，并用响应面法优化南瓜中色素提取的工艺条件，得出最佳的溶剂配比为乙醇：水：石油醚。在单因素试验基础上，选取处理时间、处理温度、石油醚用量为影响因子，以β-胡萝卜素提取率为响应值，应用Box-behnken中心组合试验设计建立数学模型，进行响应面分析。结果表明，南瓜中胡萝卜色素提取的优化工艺条件为：90 min、处理温度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡萝卜素浓度为10.086 mg/g。与模型的预测值10.105 mg/g基本相符，响应法优化能够提高南瓜色素提取率。

胡萝卜素；南瓜；提取工艺；响应面分析

南瓜含有多种营养物质，其中有多糖、蛋白质、胡萝卜素、多种维生素和钙、磷等。由于南瓜有较高的食用价值，并且还具有降糖[1-3]、降血脂[4]、抗癌[5-6]等作用，所以以南瓜为原料的功能性保健食品有着广泛的应用和发展空间[7-12]。胡萝卜素广泛的存在于动植物中，以胡萝卜、辣椒、南瓜等蔬菜中含量最多，水果、谷类、蛋黄、奶油中也有存在。胡萝卜色素主要有3种异构体，α-、β-、γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素是蔬菜、水果和动物体内胡萝卜素中一种最普遍的异构体[12]。因此，从南瓜中提取色素不仅有一定的经济价值而且还有食疗和药用价值，南瓜色素具有极大的市场潜力。

目前，从天然植物中提取β-胡萝卜素的方法很多，其中主要是以溶剂提取法为主，其他的提取技术如干燥法、微波提取、超声提取以及超临界提取等[13]方法，除此外还有用生物方法提取的胡萝卜提取β-胡萝卜素。但是，这些方法要么是由于受到外界环境条件的限制，要么使得产量很低，要么对设备要求很高，使得工业化生产收率很低，因此多不甚理想，需要进一步的研究和探讨[14]。

本研究主要以南瓜为原料，采用复合溶剂对南瓜中的色素等有用成分进行提取分离。利用响应分析法[15-16]对提取条件进行优化，探索影响提取的各因素的影响效果，以期望找出主要影响因素及提取β-胡萝卜素的最佳工艺，为工业生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

市售南瓜（黑龙江省产落花面2 kg～3 kg），颜色为黄绿色，山东产小南瓜（0.2 kg～0.5 kg），红南瓜（2 kg～3 kg）。

丙酮、无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、无水硫酸钠、氧化铝（140℃条件下活化3 h），以上试剂均为分析纯；标准β-胡萝卜色素：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

高速组织捣碎机DS-1：上海标本模型厂；T6新世纪—紫外线可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；723A可见分光光度计：上海精密仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用处真空泵：郑州盛达仪器有限公司；TD4A台式离心机：长沙英泰仪器有限公司；层析柱。

1.3 实验方法

1.3.1 南瓜样品选择及物性的测定

将适量新鲜南瓜样品切片，用高速组织捣碎机粉碎，用研钵磨碎，分别测定南瓜样品中的水分、灰分和脂肪含量。

1.3.2 不同溶剂选择

分别称取南瓜样品8 g，用50 mL丙酮、正乙烷、乙酸乙酯、石油醚为单萃取剂萃取、过滤、定容进行比色实验。分别用1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1不同比例的乙醇水溶液20 mL与上述比较最优的有机溶剂40 mL组合，配制成复合溶剂，按上述方法萃取、取上层石油醚层，定容、比色得最优溶剂。

1.3.3 南瓜中β-胡萝卜色素的提取

新鲜南瓜→清洗→破碎→粉碎成浆→准确称量→溶剂浸提→离心→清液上层过层析柱→浓缩定容→测定样品中β-胡萝卜色素→计算其含量。

准确称取南瓜样品8 g放入具塞瓶中，加入乙醇水溶液中，遮光萃取一定时间，分3次加入石油醚振荡，静止一段时间后过滤，吸取上层石油醚层，过无水硫酸钠及氧化铝层析柱，浓缩定容即为提取液、待测，水和乙醇层中可以做为提取水溶性多糖使用。

1.3.4 南瓜中β-胡萝卜色素最大吸收波长的测定

称取适量的南瓜按1.3.2节方法制成样品，在200nm～800 nm范围内进行扫描，确定其在可见光范围内的最大吸收波长。

1.3.5 标准曲线的绘制

准确称取β-胡萝卜色素标准样品20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，摇匀。取此溶液10 mL置于100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，此溶液浓度为20 mg/L。然后分别配置成浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的标准液，定容后摇匀。经全波段波长扫描可知，胡萝卜中的胡萝卜素吸收峰在451 nm，在451 nm处测定其吸光度，以胡萝卜色素质量浓度对吸光度作图，确定胡萝卜色素标准曲线。

1.3.6 单因素试验

1.3.6.1 提取时间的影响

将提取时间分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，温度25℃条件下，乙醇的水溶液20 mL，石油醚用量为40 mL条件下进行提取。

1.3.6.2 提取温度的影响

将提取温度分别设置为20、30、40、50、60℃，提取时间为1.5h，乙醇的水溶液20mL，石油醚用量为40mL条件下进行提取。

1.3.6.3 石油醚用量的影响

将提取温度分别设置为20、30、40、50、60 mL，提取时间为1.5 h，提取温度40℃，乙醇的水溶液20 mL，石油醚用量为40 mL条件下进行提取。

1.3.7 响应面法优化提取条件

根据单因素试验的结果：提取时间90 h、提取温度40℃、石油醚体积40 mL，以β-胡萝卜色素提取率为测定指标进行响应面试验。提取温度、提取时间，石油醚体积3个因素为自变量，分别以A、B、C表示，以-1、0、1代表各自变量的低、中、高水平。利用Design Expert软件分析确定最优提取工艺参数，设计方案见表1。

表1 因素水平编码表Table 1Factors and levels in central composite design

1.3.8 β-胡萝卜色素提取率的计算

式中：Y为南瓜中β-胡萝卜色素得率，（μg/g）；y为样品定容后根据标准曲线计算得到的色素含量，（g/mL）；M为原料的质量，g。

2 结果与分析

2.1 南瓜样品的物性测定

按上述提取、分析方法，分别测定所选3种南瓜样品的水分、脂肪含量、灰分和β-胡萝卜色素含量，结果见表2。

表2 不同品种南瓜中水分、脂肪含量、灰分及和β-胡萝卜色素含量（n=3）Table 2Contents of moisture，fat，ash and β-carotene in different pumpkin cultivars（mean±SE）

由表2可知，落花面、小南瓜、红南瓜脂肪含量与β-胡萝卜素含量呈正相关，这是由于β-胡萝卜色素属于油性色素，不同品种的体内脂肪含量不同，直接影响β-胡萝卜色素含量，故提取品种选择上可以先初步测定其中脂肪含量，选择脂肪含量高的作为我们提取的主要原料。

2.2 提取溶剂的选择

提取溶剂的选择见表3。

表3 提取溶剂种类的选择Table 3Selection of solvents in extraction

从表3可以看出，β-胡萝卜色素在有机溶剂中溶解效果比极性溶剂中溶解效果好，正己烷和石油醚中其提取效果都相对较好，考虑石油醚的性质和经济性故选石油醚做有机相进行下步的复合溶剂实验。

选择落花面南瓜品种，分别准确称取8 g，分别以乙醇：水：石油醚的混合体系，提取β-胡萝卜色素提取效果以吸光度值为标准，结果见表4。

从表4结果可以明显得出，乙醇：水体积比为1∶2条件下，与石油醚复配，提取β-胡萝卜素效果最好。2.3最大吸收波长的测定

以提取溶剂为反应液体作空白，测得不同波长下，提取液的吸光度，以不同吸收波长为横坐标，以吸光度为纵坐标做图，最大吸收波长的测定见图1。

表4 不同乙醇：水—石油醚体积配比下的提取样品的吸光度Table 4Absorbency of β-carotene in different proportion of ethanol：water and petroleum

图1 南瓜色素、β-胡萝卜色素全波长扫描图Fig.1 Full wavelength scanning spectrum map of pumpkin and β-carotene

由图1可以看出南瓜中色素主要以β-胡萝卜色素为主，其中还有些其它色素，南瓜中两峰值分别出现在445 nm和472 nm处，而β-胡萝卜色素标样峰值出现在451 nm处，查阅相关文献了解，β-胡萝卜色素在450 nm附近有吸收峰，所以选用450 nm波长。

2.4 β-胡萝卜色素的测定

以β-胡萝卜色素标样浓度为X轴、吸光度为Y轴，绘制标准曲线图，由标准曲线图可得回归方程y= 0.954 9x-0.055 5，相关系数R2=0.999 8，在10 μg/L～200 μg/L范围内有很好的相关性。

2.5 单因素试验

2.5.1 提取时间的对β-胡萝卜色素得率的影响

提取时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取率结果见图2。

图2 提取时间对β-胡萝卜色素得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of β-carotene

由图2可知，随着处理时间的延长β-胡萝卜色素得率先增加后减少，0～1.5 h提取率随时间呈正相关，从1.5 h～2.5 h提取率随时间呈负相关，提取时间1.5 h提取率最好，所以选择处理时间为1.5 h。

2.5.2 提取温度对β-胡萝卜色素得率的影响

不同温度下，吸光度为450 nm时，南瓜中β-胡萝卜色素得率见图3。

图3 提取温度对β-胡萝卜色素得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of β-carotene

由图3可知，随着处理温度的升高β-胡萝卜素的浓度先逐渐增加后有所降低，温度为40℃时，β-胡萝卜素的浓度最高。

2.5.3 石油醚用量对β-胡萝卜色素得率的影响

石油醚使用不同的体积时，吸光度为450 nm时，β-胡萝卜色素得率见图4。

图4 石油醚提取体积对β-胡萝卜色素得率的影响Fig.4 Effect of extraction volume of petroleum ether on the yield of β-carotene in pumpkin

由图4可知，随着石油醚用量的增大β-胡萝卜色素的浓度先增加后缓慢减少，在40 mL时最高，所以石油醚量以40 mL为较好。

2.6 响应法优化南瓜中β-胡萝卜色素的提取工艺参数

2.6.1 回归方程的建立与方差分析

响应面试验结果如表5所示，通过Design Expert数据分析软件进行回归分析，得到的方差分析结果如表6所示。

由表6可知，处理温度和石油醚用量的一次项达到显著水平（P＜0.05），处理时间的一次项未到显著水平，表明处理温度和石油醚用量对β-胡萝卜素的得率线性效应显著；二次项对β-胡萝卜素浓度的曲面效应显著；AC、BC交互效应达到极显著水平（P＜0.01），表明各影响因素对β-胡萝卜素浓度的影响不是简单的线性关系。从表6的分析结果来看，整体模型的P＜ 0.01，该二次方程模型达到极显著水平，并且失拟项不显著（P＞0.05），说明该回归方程对数据进行了较好拟合，二次回归方程为：

Y=10.06+0.16A-0.35B-0.49C+0.17AB-1.19AC-1.40BC-1.18A2-1.19B2-3.46C2

2.6.2 响应面及等高线分析结果

响应面图是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果构成的一个三维空间曲面。根据回归方程绘制响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状。图5、6是对响应值β-胡萝卜素浓度影响较大的两因素交互作用的结果，图7交互作用不显著。

表5 响应面分析方案及试验结果Table 5Experimental scheme and results of centralcomposite design

表6 回归模型方差分析Table 6Variance analysis of the regression equation for the yield xylan

图5 提取时间和石油醚量对β-胡萝卜素的浓度交互影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots the effects of extraction time and volume of petroleum ether on the yield of β-carotene in pumpkin

图6 提取温度和石油醚量对β-胡萝卜素的浓度交互影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots the effects of extraction temperature and volume of petrolem ether on the yield of β-carotene in pumpkin

图7 处理温度和处理时间对β-胡萝卜素的浓度交互影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots the effects of extraction temperature and time ether on the yield of β-carotene in pumpkin

由图5可知，处理时间在60 min～90 min范围内，石油醚用量在30 mL～40 mL范围内时，两者存在显著的增效作用，β-胡萝卜素浓度随着处理时间和石油醚用量的增加而增加；而处理时间在90 min～120 min范围内，石油醚用量在40 mL～50 mL范围内时，β-胡萝卜素浓度随着2个因素的增加反而开始降低。由图6可知，处理温度在30℃～40℃范围内，石油醚用量在30 mL～40 mL范围内时，两者存在显著的增效作用，β-胡萝卜素浓度随着处理时间和石油醚用量的增加而增加；而处理温度在40℃～50℃范围内，石油醚用量在40 mL～50 mL范围内时，β-胡萝卜素浓度随着2个因素的增加反而开始降低。

为了确定最佳点的值，对模型进行分析，以得到最高β-胡萝卜素浓度的最佳提取工艺条件，经分析得出最佳提取条件为处理时间92.90 min、处理温度38.75℃、石油醚用量38.67 mL，β-胡萝卜素浓度为10.105 mg/g。

2.7 验证试验

为检验实验的可靠性，采用上述最优提取条件进行南瓜中胡萝卜素的提取，同时考虑到实际操作的便利，最佳条件修正为处理时间90 min、处理温度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡萝卜素浓度为10.086 mg/g。与预测值比较可知，响应面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

在对南瓜提取溶剂的选取上，采用复合溶剂提取使提取率明显增大，得出最佳的复配溶剂为：乙醇：水：石油醚，且剩余的乙醇相可以做水溶性副产物的提取所用，得到乙醇：水的最佳配比浓度为1∶2。采用中心组合试验设计，进行响应面分析结合实际值确定胡萝卜素提取的最佳工艺条件为处理时间93 min、处理温度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡萝卜素浓度为10.086 μg/mL。处理温度和石油醚量对β-胡萝卜素的浓度影响显著，处理时间的影响不显著；处理时间与石油醚用量和处理温度与石油醚用量的交互项对β-胡萝卜素浓度的曲面效应显著。

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Response Surface Methodology Optimization of β-Carotene in Pumpkin Extraction Process

YU Kai-yuan1，JU Xiao-feng2，ZHENG Li-na1，SUN Qing-rui1，LIU Zhi-ming1，LI Xiu-bo1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Taking pumpkin as raw material，using the composite solvent extraction of pumpkin and response surface methodology was applied to optimize of the extraction of carrot pigment from pumpkin.Based on single factor experiment，selection of processing time，temperature，petroleum ether used as impact factor，and the β-Carotene concentration was selected as response value and the mathematical model was established by Boxbehnken central composite design.The optimal fermentation conditions were determined as follows：processing time 90 min，treatment temperature 40℃，petroleum ether dosage was 40 mL.Through verification experiment numerical 10.086 mg/g.With the model of the predictive value of 10.105 mg/g basically，response method optimization can improve the extraction rate of pigment from pumpkim.

carotene；pumpkin；extraction process；response surface analysis

2013-10-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.007

于开源（1978—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品物理化学、食品安全检测。