不明原因不孕患者血清中抗核抗体、抗心磷脂抗体和抗β2 糖蛋白I抗体的检测价值

曾勇，梁佩燕，刁梁辉，赵明，黄春宇，陈伟洪，金燕，陈现

（深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045）

目前全球不孕不育的发病率约为育龄夫妇的9%，并有逐年升高的趋势［1］。IVF-ET 及其衍生技术是一种有效的治疗方法，它的迅速发展提高了不孕症治疗的成功率。该技术发展20多年来，尽管临床促排卵方案及胚胎培养技术有了很大的改善，但IVF-ET 成功妊娠率仍徘徊在30%～50%［2］，其治疗效果远未达到人们的期望。在排除高龄、遗传、内分泌和解剖结构等异常因素后，仍有15%左右的不孕患者病因不明［3］，通常这部分患者被定义为不明原因不孕（UI）患者。如何改变UI患者的治疗结局、提高胚胎成功种植率一直是该领域专家和学者们所关注的热点问题。近年来，生殖免疫学研究表明胚胎种植失败可能与母体的免疫状态异常有关［4］，自身免疫因素在胚胎种植失败患者中所起的作用已逐渐引起人们的重视。大量研究资料表明自身抗体如抗核抗体（ANA）、抗心磷脂抗体（aCL）和抗β2 糖蛋白I抗体（aβ2-GPI）的存在可能与复发性流产和反复种植失败有关［5-7］，但与UI的关系尚不明确。因此，本研究通过联合检测并分析UI患者血清中的ANA、aCL 和aβ2-GPI三项指标，综合判断对UI的临床应用价值，为寻找UI患者的致病因素提供新的诊断指标。

材料与方法

一、研究对象

本研究选取2015年1 月～4 月首次在本院生殖医学中心接受IVF-ET 标准方案的108例UI患者作为研究对象即UI组。所有患者均经过详细询问病史、全身及妇科检查、染色体核型分析、宫腔感染和宫腔镜以及内分泌等系统性检查，入选标准为：（1）年龄≤35岁；（2）卵巢储备功能正常；（3）夫妇双方染色体核型正常，女方无感染、子宫解剖结构正常、内分泌正常、无输卵管堵塞；（4）男方精液常规检查正常；（5）无自身免疫疾病史；（6）无手术史和激素治疗史；（7）原发不孕。同时选取在本中心工作的具有正常妊娠史的女性，共24 例为对照组，年龄为21～35岁。

所有患者在IVF-ET 进周前当月的月经周期第3～5天抽取周围血，正常对照组在同期抽取周围血，采血后离心分离血清，分别检测血清中ANA、aCL和aβ2-GPI抗体水平。本研究入选患者和正常对照的志愿者均签署了检测项目知情同意书，实验流程获得医院学术与伦理学委员会许可。

二、实验设备和试剂

实验设备主要包括Luminex 200蛋白液相芯片系统（Luminex，美国）和Bio Tek Eon 微孔板分光光度计（BioTek，美国）。试剂主要包括AtheNA Multi-LyteTM抗核抗体检测试剂盒（Zeus，美国），抗心磷脂抗体IgG／IgM 测定试剂盒（Inova，美国）和抗β2 糖蛋白I抗体IgG／IgM 检测试剂盒（Inova，美国）。

三、实验方法

1.ANA 谱检测：ANA 谱的检测应用多重微珠免疫法，采用AtheNA Multi-LyteTM抗核抗体检测试剂盒检测患者血清中9个ANA 标志物，包括抗干燥综合征抗原A 抗体（SSA）、抗干燥综合征抗原B抗体（SSB）、抗小核糖核蛋白抗体（Sm）、抗核糖核蛋白抗体（RNP）、抗硬皮病70 抗体（Scl-70）、抗组氨酰合成酶转运核糖核酸抗体（Jo-1）、抗着丝点蛋白B抗体（CentB）、抗组蛋白抗体（AHA）和抗双链DNA 抗体（dsDNA）。血清先用稀释液按1∶21进行稀释，向各孔中加入50μl微珠悬浮液，再将已1∶21稀释的样本各取10μl依次加入到微孔板中，室温孵育30min后清洗微球，去除不反应的血清蛋白。每孔中加入150μl PE 标记的羊抗人IgG，混匀，室温孵育30 min，通过Luminex 200 对微球悬浮液进行分析。同时利用内校正技术，内对照颗粒上的荧光信号可以将读到的荧光强度转换成浓度（单位）结果。阳性判断标准：各单个ANA 浓度＞120U／ml定义为阳性。ANA 谱中9个标志物中的一个或几个同时阳性均视为ANA 阳性。

2.aCL和aβ2-GPI IgG／IgM 检测：aCL 和aβ2-GPI的检测采用酶联免疫吸附法。血清先用稀释液按1∶101进行稀释，再往预包被板中依次加入标准品、质控品和待测样品100μl，室温孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl抗人IgG／IgM HRP 结合物，室温避光孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl TMB溶液（3’3’5’5-四甲基联苯胺溶液），孵育30min后，加入100μl终止液终止反应。于波长450nm 处读取OD 值，用折线拟合方式计算各样品浓度值。阳性判断标准：aCL-IgG≥20GPL／ml、aCLIgM≥20 MPL／ml，或aβ2-GPI-IgG≥20SGU、aβ2-GPI-IgM≥20SMU 定义为阳性。

四、统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对UI患者组和正常对照组基线资料进行独立样本t检验分析，两组自身抗体阳性率进行χ2检验分析，以P＜0.05为有统计学差异。

结 果

一、UI患者与对照组基本资料

资料显示，年龄、身体质量指数（BMI）以及基础内分泌激素等可能对自身抗体阳性的风险具有一定的影响，所以我们比较了UI组和对照组的基本资料。与对照组相比，UI组的年龄、身体质量指数（BMI）、雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）、促卵泡雌激素（FSH）、泌乳素（RPL）和孕酮（P）的表达水平均无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

二、UI患者血清中ANA 的检测结果

UI患者血清中ANA 总的阳性率为14.8%，其中抗SSA、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、CentB、AHA、dsDNA 等 抗 体 的 阳 性 率 分 别 为7.4%（8／108）、1.9%（2／108）、0、0.9%（1／108）、0.9%（1／108）、3.7%（4／108）、0.9%（1／108）、1.9%（2／108）和0，正常对照组中无一例ANA 阳性。两组ANA总阳性率相比，具有显著性差异（P＜0.05），而两组间相应的单一抗体比较均无显著性差异（P ＞0.05）。

三、UI患者血清中aCL检测结果

UI患者血清中aCL 总阳性率为38.0%，其中aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗体阳性率分别 为25.0%、9.3% 和3.7%。aCL 总 阳 性 率 和aCL-IgG 抗体阳性率均显著高于对照组（P ＜0.05），而aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗体阳性率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

四、UI患者血清中aβ2-GPI检测结果

结果所示，UI患者血清中aβ2-GPI总阳性率为9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPIIgG-IgM 抗体阳性率分别为0、9.3%和0，与正常对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表1 UI组与正常对照组基本资料比较［±s］

表1 UI组与正常对照组基本资料比较［±s］

组 别 例数 年龄（岁） BMI（kg／m2） E2（pmol／L） LH（U／L） FSH（U／L） PRL（mU／L） P（nmol／L）UI组 108 30.5±2.9 21.1±1.9 133.6±13.4 4.2±1.6 6.1±1.5 318.1±86.0 0.9±0.1对照组 24 29.3±2.9 21.1±2.4 124.8±11.1 4.4±1.6 6.8±1.6 358.3±92.5 1.2±0.2

表2 UI组与正常对照组aCL阳性率比较［% （n）］

表3 UI组与正常对照组aβ2-GPI阳性率比较［%（n）］

讨 论

近年来随着生殖免疫学的研究进展，免疫因素和不孕不育的关系日益受到人们的重视，一种或多种自身抗体的存在常反映机体自身免疫状态的异常，而不利于女性生殖健康。自身抗体如ANA、aCL和aβ2-GPI被认为可能是引起不孕不育症、复发性流产和其它一些妊娠并发症的重要因素［8］。但是，ANA、aCL和aβ2-GPI这3种抗体与UI的潜在相关性目前报道较少。因此，本研究希望通过检测和分析UI患者血清中ANA、aCL 和aβ2-GPI的阳性率，明确ANA、aCL和aβ2-GPI是否可作为UI患者行IVF-ET 前病因筛查的检测指标。

ANA 是一组对自身真核细胞内的DNA、RNA、蛋白质和可提取的核抗原等作为靶抗原的自身抗体的总称［9］。ANA 可穿透细胞膜进入活细胞中，产生抗体介导的细胞毒作用，中断细胞有丝分裂进程，使 得DNA 合 成 受 阻［10］。Ying 等［11］研 究 发现ANA 可影响卵母细胞成熟和早期胚胎细胞分裂，其ANA 阳性组MII卵细胞比率、2PN 受精卵比率、卵裂率和可用胚胎以及优质胚胎数量都显著低于ANA 阴性组，并且胚胎种植率和临床妊娠率也显著降低，由此作者认为ANA 对卵母细胞成熟和胚胎细胞分裂的影响，可能是胚胎在种植前便成为了ANA 攻击的目标。这些结果提示以细胞核成分为主要靶目标的ANA 很有可能是引起胚胎种植失败的重要原因。ANA 与包括复发性流产和反复IVF-ET 失败等在内的多种不良妊娠结局密切相关，在复发性流产患者中，ANA 阳性率可高达50%［12］，在反复IVF-ET 失 败 患 者 中ANA 的 阳 性率为35.1%［13］，另外，在IVF-ET 不孕患者中ANA阳性率为20%～28.7%［14-15］，而本研究结果显示，UI患者ANA 总阳性率为14.8%，与对照组相比具有显著性差异。由此推测，ANA 阳性可能与UI有关。

aCL是抗磷脂抗体（aPLs）的标志性抗体之一，主要以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂为靶抗原，在正常生理条件下不存在，一般出现在组织炎症、粘连及损害后，可引起血管内血栓形成，从而引发胎盘与蜕膜血流不畅以及供血不足等情况，最终导致流产［16］。aCL 引 起IVF 种 植失 败 的 可 能 作用机理为［17］：（1）aCL在卵泡液中聚集，并粘附到卵母细胞细胞表面，从而干扰卵母细胞形成；（2）aCL可直接结合到胚胎上，导致胚胎发育延滞和胚胎形态异常；（3）aCL可抑制子宫内膜的蜕膜化，降低子宫内膜容受性。目前普遍认为aCL 与复发性流产、先兆子痫、IVF-ET 失败等生殖障碍疾病有关。本研究UI组aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗体阳性率分别为25.0%、9.3%和3.7%，与对照组相比，aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗体阳性率无显著差异，但aCL总阳性率和aCL-IgG 抗体阳性率均显著高于正常对照组（P＜0.05），由此我们推测aCL阳性，特别是aCL-IgG 抗体阳性可能与UI有关。本研究UI患者血清中aCL总阳性率与早期研究结果一致（42%）［18］，但显著高于Radojcic′等［19］报道的aCL阳性率（23.8%）。这种差异性可能主要是由于阳性阈值的设定和检测方法不同而引起的。

β2-GPI是由Ⅰ-Ⅴ五个共同序列的功能区即补体调控结构域构成的血浆蛋白质，Ⅰ和Ⅴ结构域可与带负电荷的磷脂结合，主要以Ⅴ结构域为主导作用，而 以β2-GPI 为 靶 目 标 的aβ2-GPI 或aCL 等aPLs结合位点位于Ⅰ结构域。研究表明，β2-GPI作为最重要的aPLs结合辅因子，可与内皮细胞、单核细胞、血小板、滋养层细胞和蜕膜细胞表面受体以及凝血因子相互结合，介导炎症反应、细胞凋亡、内皮细胞损伤、凝血功能异常等［20］。而aβ2-GPI一方面在血栓形成过程中具有致病作用，可干扰β2-GPI的抗凝血功能；另一方面，aβ2-GPI可与蜕膜细胞发生反应，诱导母体子宫内膜促炎性状态的发生，产生白 介 素-8 （IL-8）、IL-1 和 单 核 细 胞 趋 化 蛋 白-1（MCP-1）等促炎细胞因子，干扰胚胎着床，导致天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）介导的滋养层细胞死亡，而引起妊娠失败［21］。研究表明aβ2-GPI与IVF种植失败和复发性流产患者等不良妊娠结局有关，其血清中aβ2-GPI抗体阳性率分别为9%和16%，均显著高于正常可孕妇女［5］。因此，本研究通过检测UI患者和正常对照组血清中aβ2-GPI的阳性率，探讨aβ2-GPI与UI的关系。检测结果显示aβ2-GPI的总阳性率为9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPI-IgG-IgM 抗体阳性率分别为0、9.3%和0，与正常对照组比较均无显著性差异，由此推测，aβ2-GPI阳性可能与UI无关。

同时，大量的研究表明：对自身抗体ANA 和aCL阳性的IVF-ET 患者给予强的松和阿司匹林治疗后，可显著的提高胚胎种植率和临床妊娠率［22-23］。而对自身抗体阳性的UI患者进行免疫干预治疗的研究目前尚未见报道。因此，这有待于我们进一步深入的研究，以期更好的阐明自身抗体阳性对UI患者妊娠结局的影响，为UI的临床治疗提供理论依据。

综上所述，UI患者血清中ANA 和aCL总阳性率显著高于正常已孕妇女，这可能是UI患者不孕的重要因素之一，可作为UI病因筛查的重要检测指标。

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