猴耳环水提物对免疫性肝损伤小鼠血液生化指标的影响

谭滴清，潘卫松 ，肖 瑛 ，马景涛 ，孙永学，符路娣

(1.广州中医药大学，广州510405；2.广州市药品检验所，广州510160；3.暨南大学，广州510632；4.华南农业大学，广州510642)

猴耳环水提物为棕黑色膏状体，在广东民间较为常用，其抗菌、抗炎作用在临床用药实践中已得到证实，但目前研究对其作用机理尚未明确。据于猴耳环的众多功效，本文拟通过建立小鼠免疫性肝损伤模型，观察猴耳环水提物对小鼠免疫性肝损伤的血液生化指标的影响，进一步探讨猴耳环水提物对免疫性肝损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 SPF级昆明小鼠50只，体重18-22g，雄性，由广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证编号：SCXK（粤） 2013-0020。使用许可证编号：SYXK（粤） 2008-0001。

1.2 药品与试剂 中药猴耳环浸膏（批号：121105，含没食子酸5.1%），由广州莱泰制药有限公司提供；环孢菌素A软胶囊,由中美华东制药公司提供；P.acnes菌株,由广东省微生物菌种保藏中心提供；各种生化试剂盒,均由上海科华生物工程股份有限公司提供；细菌内毒素工作标准品（批号：150601-201174） ,由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 主要仪器 电子天平(型号:AL204,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产；台式高速冷冻离心机(型号:MulitifugellR)；日立7060全自动血生化分析仪。

1.4 试验设计 将KM小鼠随机分为空白对照组、P.acnes-LPS模型组、CsA组、猴耳环水提物高剂量组、猴耳环水提物低剂量组共5组，每组10只。适应性喂养一周后开始实验，试验第一天每只小鼠，尾静脉注射8mg·kg-1热灭活P.acnes生理盐水溶液，试验第五天每只小鼠尾静脉注射5ug/kg LPS-PBS溶液。P.acnes负荷前每天灌胃1次连续7d，用猴耳环水提物水溶液灌胃，其中高剂量给予5.82mg·kg-1，低剂量给予2.91mg·kg-1。末次给药在LPS注射30min前，对照组给予等容量0.9%氯化钠注射液。CsA从P.acnes负荷后一天起灌胃给药，剂量为5mg·kg-1。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 血液生化指标检测 在试验结束时，采集各组小鼠血样，使用离心机分离血样（3000r/min,10min），采用全自动化生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）。

1.5.2 肝脏组织学检查 取小片肝组织于10%甲醛溶液中固定，HE染色，光镜下观察。

1.6 统计学处理 实验数据以STATA 13.0统计软件包处理实验数据，实验数据以X±s表示,采用方差分析进行统计学分析。

2 结果

2.1 猴耳环水提物对免疫性肝损伤小鼠血液生化指标的影响

表1的结果显示，模型组小鼠较正常组相比血清ALT水平明显升高，不同剂量猴耳环水提物均可降低P.acnes-LPS负荷小鼠血清ALT水平,且呈一定量效关系。对照药CsA也同样显著抑制因P.acnes-LPS负荷而引起的小鼠血清ALT活性的升高（P<0.05）。模型组小鼠血清TP含量减少、ALB含量下降、GLO升高。猴耳环水提物组小鼠血清中的ALB、TP有所下降，但与模型组比较无统计学意义（p>0.05）。说明本猴耳环水提物对免疫性肝损伤小鼠有一定的治疗效果。

2.2 猴耳环水提物对免疫性肝损伤小鼠肝脏组织病理学变化的影响

光镜下正常小鼠肝组织结构清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列。模型组小鼠肝细胞呈较广泛的嗜酸性坏死,肝组织镜下可见肝细胞肿胀较明显，胞浆疏松透亮，部分呈气球样变少数出现广泛的肝细胞坏死,肝细胞浊肿有点状坏死及小灶性坏死，可见散在的肉芽肿形成,汇管区有大量炎性细胞浸润;CsA组小鼠肝组织切片见肝细胞普遍水肿，胞浆疏松但较模型组轻，未见肝细胞坏死、炎细胞浸润等改变；猴耳环水提物高剂量组见肝细胞水肿改变较轻，未见肝细胞坏死、炎细胞浸润等改变；猴耳环水提物低剂量组未见肝细胞水肿、坏死、炎性细胞浸润等表现。其中猴耳环水提物低剂量的肝细胞损伤程度最低。提示猴耳环水提物对P.acnes-LPS诱导的免疫性肝损伤有一定的保护作用。

表1 猴耳环水提物对肝损伤小鼠血液ALT、AST、ALB、GLO、TP 水平的影响（X±s，n=10）

（图1 各组小鼠光镜下病理变化图， 转见第24 页下方）

3 讨论

猴耳环是一味较为名贵的中药，其在治疗上呼吸道感染，咽炎，咽喉炎，急性扁桃体炎，急性胃肠炎，细菌痢疾等方面具有良好的临床效果。其叶、果实、种子：清热解毒，凉血消肿，并可外用于烧烫伤、疮疡痈疖肿。全国中草药汇编记录其味功能微苦微涩，凉。清热解毒，凉血消肿。外用于烧伤、烫伤、疮痈疖肿。宋玉乔等[1]证实猴耳环中的槲皮苷能降低血压、保护心肌缺血再灌注损伤，有抗氧化、清除氧自由基、增强免疫功能及抗癌、抗菌、抗病毒和镇痛等作用。李药兰等[2]发现猴耳环中的没食子酸甲酯成分具有较好的体外抗呼吸道合胞病毒（RSV） 活性。吴蓉蓉等[3]研究发现，猴耳环水提取物或醇提取物对流感病毒甲3型、副流感病毒1型、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒1和2型（HSV-1，HSV-2） 、肠道病毒CoxB3、鼻病毒（RV）、腮腺炎病毒均有抑制作用，且有很强的抗氧化活性。

猴耳环水提物功效之多，使其成为为提高免疫性肝损伤治疗效果药物的优选研究药物。而注射P.acnes和LPS可诱导小鼠产生严重的免疫性肝损伤模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程，是筛选保肝药物较为理想的模型之一[4]。方士英等[5]研究证明由于P.acnes-LPS诱发肝损伤可以被CsA等免疫抑制剂所抑制，因此认为P.acnes-LPS肝损伤模型近似自身免疫性肝炎的病理过程，其病变与慢性肝炎非常接近。

血液生化指标能很好的地反映机体生理代谢状态，也是机体新陈代谢机能的反映。因而临床诊断上血液生化指标便成为优选诊断方式。大部分球蛋白具有免疫功能，免疫球蛋白在人体血清中具有抗体活性，能够抗菌、抗病毒、加强细胞的吞噬作用，是引发机体体液免疫的重要物质[6]，GLO含量的高低在一定程度上反映了动物机体免疫功能的好坏。ALT在肝脏中的含量最为丰富，只分布于细胞浆中，ALT升高，就提示肝细胞发生了损伤，是医学上肝功能检査的指标。AST在提示肝细胞损伤方面灵敏度不如ALT，因为其主要存在于肝细胞的线粒体之屮，而ALT主要存在线粒体之外。只有在严重的肝细胞损伤时，线粒体膜才会受损，从而AST浓度才会升高。

本实验过程中P.acnes-LPS染毒小鼠可引起肝组织损伤导致血清ALT活性升高，通过猴耳环水提物治疗后小鼠血清ALT活性降低。对照药CsA也同样显著抑制因P.acnes-LPS负荷而引起的小鼠血清ALT活性的升高（P<0.05）。模型组小鼠血清TP含量减少、ALB含量下降、GLO升高。猴耳环水提物组小鼠血清中的ALB、TP有所下降但，各组TP、ALB、GLO含量差异不显著（P>0.1）。显示猴耳环水提物不是直接影响机体对蛋白质的利用程度及对血液渗透压，此次试验中ALB对组织的修补能力不显著。肝脏组织学显示猴耳环水提物可一定程度的改善肝组织的病理学变化。以上实验说明了本猴耳环水提物对P.acnes-LPS致小鼠免疫性肝损伤小鼠有一定的治疗效果。

[1]宋玉乔,姚凌云,曹蔚,等.槲皮素的药理作用研究近况[J].西北药学杂志,2002(01):40-42.

[2]李药兰,李克明,苏妙贤,等.猴耳环抗病毒有效成分研究[J].中国中药杂志,2006(05):397-400.

[3]吴蓉蓉,黄杰昌,雷佳,等.猴耳环提取物的新用途:2006-10-25

[4]Nigam SK,Mitra CR.Pithecolobium dulce.IV.Constituentsof flowers,heartwood and rootbark.[J].Planta Medica,1968,16(3):335-337.

[5]方士英,徐茂红,叶良兵,等.冬虫夏草对免疫性肝损伤小鼠模型的保护作用研究[J].中国免疫学杂志,2011(10):891-894.

[6]AktasO,Zipp F.Regulation ofSelf-Reactive TCellsby Human Immunoglobulins-Implications forMultiple SclerosisTherapy[J].CurrPharm Des,2003,9(3):245-256.

图1 各组小鼠光镜下病理变化图（X100 倍）