Box-Behnken 效应面法优化侧柏叶总黄酮提取工艺

丘思兰，谭志灿，黄洁靖，利创华2，

（1.广州医科大学附属第五医院，广东广州510700；2.广州中医药大学，广东广州510405；3.广州市医药职业学校，广东广州510430）

侧柏叶，别名柏叶、扁柏叶、丛柏叶，为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥枝梢和叶。一般在夏、秋二季采收，阴干，我国大部分地区均有产。侧柏叶味苦、涩，性寒。归肺、肝、脾经。具有凉血止血，化痰止咳，生发乌发的作用。用于吐血，衄血，咯血，便血，崩漏下血，肺热咳嗽，血热脱发，须发早白等症[1]。

侧柏叶主要含有黄酮类化合物、挥发油、鞣质等成分[2-4]。现代药理研究表明，侧柏叶具有抑菌、止血、抗肿瘤、抗炎、抗红细胞氧化等作用[5-9]。侧柏叶的主要药效成分为黄酮类化合物。本实验采用Box-Behnken 效应面法对侧柏叶总黄酮的提取工艺进行研究，为充分发挥其药用价值提供实验依据。

1 仪器与材料

SP-756PC 型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；HH-8 型数显恒温水浴锅（金坛市成辉仪器厂）；AL104 型电子分析天平（上海梅特勒托利多仪器有限公司）。

侧柏叶药材购自广东和翔制药有限公司（批号20140203），经鉴定为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥枝梢和叶；槲皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111538-200504）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 侧柏叶总黄酮的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品12.05mg，置25mL 量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。含槲皮苷0.482mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取侧柏叶药材粉末1g，置50mL 圆底烧瓶中，加石油醚25mL，回流脱脂两次，每次2h，取药渣干燥，并按照表1 试验设计制备供试品溶液。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取上述槲皮苷对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分别置25mL 量瓶中，加乙醇至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白对照，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010 年版一部附录ⅤA），在最大吸收波长500nm 处测定其吸光度A，以吸收度A 为纵坐标，浓度C 为横坐标，绘制标准曲线。得标准曲线A=14.070 3C－0.003 3，r=0.999 7，线性范围为0.009 64～0.057 84mg/mL。

2.1.4 样品测定

精密量取供试品溶液0.5mL，置25mL 量瓶中，照“2.1.3”项下的方法，自“加乙醇至6mL”起依法测定其吸光度，并计算样品中总黄酮的含量。

2.2 Box-Behnken 效应面法优选最佳提取工艺

在单因素试验的基础上，采用回流提取法，固定提取数为2 次，提取温度85℃，选取乙醇浓度、溶剂体积、提取时间为考察因素，以侧柏叶总黄酮的提取率为响应值，试验安排及结果见表1。0.01），乙醇浓度的二次项对侧柏叶总黄酮提取率达显著水平（P＜0.05）。采用Design Expert 软件作出相应的等高线图和效应面图，见图1-6。

表1 侧柏叶总黄酮的提取工艺优选Box-Behnken试验安排及结果

表2 回归方程的显著性检验及方差分析

利用ANOVA 分析效应面的回归参数。采用Design Expert 7.0.0 软件对表1 数据进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程：

Y = - 2.733 29 + 0.031 120A + 0.094 271B +0.057 861C + 2.500 00×10-4AB - 1.111 11×10-5AC -4.166 67×10-5BC-2.259 26×10-4A2-3.489 58×10-3B2-3.259 26×10-4C2（相关系数R2=0.984 7，变异系数C.V.为1.61%）

结果表明，该模型拟合度良好。

表2 为回归方程的显著性检验及方差分析。乙醇浓度的一次项，溶剂体积、提取时间的一次项和二次项对侧柏叶总黄酮提取率达极显著水平（P＜

图1 因素A 和因素B 对响应值Y 的等高线图

图2 因素A 和因素B 对响应值Y 的效应面图

图3 因素A 和因素C 对响应值Y 的等高线图

图4 因素A 和因素C 对响应值Y 的效应面图

图5 因素B 和因素C 对响应值Y 的等高线图

图6 因素B 和因素C 对响应值Y 的效应面图

2.3 验证试验

由二次多项式回归模型得出最佳提取工艺参数为乙醇浓度75.44%，溶剂体积15.70 倍，提取时间86.46min。在此条件下，侧柏叶总黄酮理论提取率为1.681 9%. 对最佳提取工艺进行3 次验证试验，结果总黄酮平均提取率1.6728%（RSD=0.902%）. 表明所优选的提取工艺稳定可行、重复性良好。

3 讨论

目前，提取工艺的优选多采用正交设计和均匀设计，虽然试验次数少，但结果精度低。在给出的整个区域内，不能找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域中因素的最佳组合和响应的最优值。Box-Behnken 效应面法采用多元二次方程，拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析以寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法[10-12]。

本实验在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 效应面法，考察乙醇浓度、溶剂体积、提取时间3 个因素对侧柏叶总黄酮提取率的影响。方差分析结果可见，3 个因素的一次项和二次项均具有显著性，3 个因素之间的乘积项均无显著性，表明各因素之间的相互作用较小。二次多项式回归模型可以达到极显著水平，且失拟项不显著，表明回归方程对试验拟合较好。通过验证试验，最终确定最佳提取工艺参数为乙醇浓度75.44%，溶剂体积15.70倍，提取时间86.46min。本实验为充分发挥侧柏叶药用价值提供实验依据，也为效应面法在中药提取工艺的应用提供示范性研究。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2010：200.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草（精选本）[M]. 上海：上海科技出版社，1998：321.

[3] 林启寿. 中草药成分化学[M]. 北京：科学出版社，1977：577.

[4] 王建新，周忠，严冲，等. 化妆品植物原料手册[M]. 北京：化学工业出版社，2009：370.

[5] 刘爱如，田樱，程立方. 山东地区侧柏叶止血和抑菌作用比较[J]. 山东中医学院学报，1995，19（1）：47-49.

[6] 李园园，郝双红，万大伟，等. 侧柏乙醇提取物对21 种植物病原真菌的抑菌活性[J]. 西北植物学报，2005，28（5）：1056-1060.

[7] 公衍玲，金宏，王宏波. 侧柏叶挥发油提取工艺及其抑菌活性研究[J]. 化学与生物工程，2009，26（2）：36-38.

[8] 梁统，覃燕梅，梁念慈，等. 侧柏总黄酮的抗炎作用及机制[J]. 中国药理学通报，2003，19（12）：1407-1410.

[9] 丁航，刘慧明，梁统，等. 侧柏叶中黄酮类化合物对H2O2诱导的人红细胞氧化作用的影响[J]. 实用临床医学，2003，4（3）：23-24.

[10] 余子川，余捷婧，韩建伟. Box-Behnken 效应面法优化地乌总皂苷提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：50-53.

[11] 邱颖，朱玲，孙晓英. 星点设计-效应面优化法与正交设计和均匀设计的比较及其在药剂研究中的应用[J]. 海峡药学，2011，23（2）：18-20.

[12] 吴伟，崔光华. 星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用[J]. 国外医学·药学分册，2000，27（5）：292.