整体柱在线固相微萃取－高效液相色谱同步富集检测水中的苯氧羧酸类除草剂

王家斌， 吴芳玲， 赵 琦

（福州大学生物和医药技术研究院，福建福州350002）

苯氧羧酸类除草剂是最早开发成功并广泛用于农林业生产的一类有机选择性除草剂，其对植物有强烈的生理活性，具有高效、内吸、高度选择性等特点［1］。从化学结构上看，苯氧羧酸类化合物容易成盐，这使得其很容易溶解于地表水中，并迅速扩散，导致周围环境的大面积污染进而严重威胁人类健康。虽然苯氧羧酸类除草剂本身只具有中等毒性，但其代谢产物（特别是一些卤化物）对人类和生物体会造成严重危害［2］。研究表明，这些代谢产物可以引发人类软组织恶性肿瘤，对动物体表现出胎盘毒性。现今，全球苯氧羧酸类除草剂的生产和使用量仍居高不下，由于该类除草剂的潜在危害性，对它们在环境和作物中的残留量检测也越来越重要。国内外对于苯氧羧酸类农药的残留都制定了严格的残留限量。我国2006年颁布的国家标准《生活饮用水卫生标准》将2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的限值规定为0.03 mg／L［3］；世界卫生组织 2011 年颁布的《饮用水水质指南》规定饮用水中2，4-D的限量指导值为 30 μg／L、2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸（2，4-DP）的限量指导值为 100 μg／L［4］。

目前，苯氧羧酸类除草剂的残留检测方法有气相色谱-电子俘获检测法（GC-ECD）［5］、气相色谱-质谱联用检测法（GC-MS）［6］、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）［7］、高效液相色谱-二极管阵列检测 法［8］、液 相 色 谱-质 谱 联 用 检 测 法 （LCMS）［9-11］、电泳检测法（CE）［12，13］以及酶联免疫检测法（ELISA）［14］等。其中，气相色谱法和高效液相色谱法是最为通用，同时也是许多标准中使用的检测方法。对比气相色谱法，高效液相色谱法由于无需对样品进行衍生，简化了操作步骤，减少了干扰，因此更适用于苯氧羧酸类除草剂的检测。

此外，由于实际样品成分复杂，多含有易损害色谱柱的大分子物质；而且对于可疑样品，特别是含量较低的样品，需要结合前处理富集技术，提高检测灵敏度。管内固相微萃取（in-tube SPME）技术是一种少溶剂的固相微萃取技术，具有操作简单、耗时少、效率高、易于自动化和与其他技术在线联用等优点［15］。固相微萃取与高效液相色谱在线联用，不仅可以简化样品前处理步骤，而且可以实现分析的自动化，提高分析的灵敏度［16］。

由于聚合物整体柱具有原位制备、通透性好，传质阻力低、表面易于改性等优点［17-19］，近年来在固相（微）萃取介质［17，20-22］、色谱分离介质（色谱整体柱）［23-25］等领域得到广泛应用。罗伟强等［20］在不锈钢管内制备聚（甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯）整体柱作为萃取柱，并用于水果中氯吡脲的分析测定；Wang等［21］以掺杂单壁碳纳米管的聚（甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯）整体柱为管内固相微萃取整体柱，采用管内固相微萃取-实时直接分析质谱法联用在线富集检测样品中的6种三嗪类除草剂。

本论文以自制C18毛细管整体柱作为固相微萃取柱，构建在线固相微萃取-高效液相色谱（intube SPME-HPLC）联用系统，同步富集检测5种苯氧羧酸类除草剂（即2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），苯氧丙酸（PPA），2-（2-氯）-苯氧丙酸（2，2-CPPA），2-（3-氯）-苯氧丙酸（2，3-CPPA），2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸（2，4-DP）），考察了 in-tube SPME-HPLC联用系统主要运行参数对5种苯氧羧酸类除草剂富集检测的影响，并利用联用系统检测了环境水样中的5种苯氧羧酸类除草剂。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

EasySep-LC1010液相色谱仪（美国Unimicro Technologies公司）；LC-10AD液相色谱泵（日本岛津公司）；XL30ESEM电子扫描显微镜（荷兰FEI公司）；GL-16C离心机（最高转速16 000 r／min）（上海安亭科技仪器厂）；601超级恒温水浴（江苏省金坛市医疗仪器厂）；Milli-Q Reference型超纯水系统（美国 Millipore公司）。液相色谱分析柱Gemini 5u C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）（美国Phenomenex公司）。

甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）（美国 ACROS 公司）；环己醇、1，4-丁二醇（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯，上海试剂四厂）；乙腈（ACN）、甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸、氢氧化钠和三氟乙酸（TFA）（分析纯，上海试剂总厂）。所用水均为超纯水，由Milli-Q reference型超纯水系统制得。熔融石英毛细管（250 μm i.d.，375 μm o.d.，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。纯氮气（N2，福州开发区友辉气体有限公司）。除草剂标准品：2，4-D、PPA、2，2-CPPA、2，3-CPPA、2，4-DP购自美国SIGMA公司。检测水样取自福州市闽侯县上街镇厚美村和浦口村。

1.2 溶液配制

0.1%TFA溶液：取1 mL TFA溶于超纯水，并移入1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容，即得0.1%的TFA溶液。使用前需要用水系滤膜过滤，再超声脱气30 min。苯氧羧酸类标准储备液：分别称取适量的 2，4-D、PPA、2，2-CPPA、2，3-CPPA 和 2，4-DP溶解于乙腈中，配制成100 mg／L的标准储备液。实验前用流动相配制成所需浓度的标准溶液。

1.3 样品处理

取10 mL（精确到0.01 mL）的检测水样，先用0.01 mL的TFA进行酸化处理，在转速为5 000 r／min 下离心5 min，取上清液用 0.22 μm 水系滤膜过滤，用于in-tube SPME-HPLC联用系统测定。

1.4 固相微萃取整体柱的制备

在制备固相微萃取整体柱时，为保证毛细管整体柱内连续床层固定相稳定、不移动，首先对毛细管内壁进行预烯基化处理，在毛细管内壁键合上一层带烯基官能团的硅烷化试剂［26］。整体柱制备方法参考文献［27］。整体柱反应液由功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂组成，其中：SMA（18.0%，质量分数）作为功能单体；EDMA（12.0%，质量分数）作为交联剂；环己醇（56.0%，质量分数）和 1，4-丁二醇（14.0%，质量分数）为致孔剂；AIBN（按单体质量的0.3%加入）作为引发剂［18］。反应液用漩涡混合器混匀，超声15～20 min，用0.22 μm 有机系微孔滤膜过滤。之后用微孔注射器将处理好的反应液匀速注满已经预处理过的毛细管空管，用气相色谱进样橡胶垫片将毛细管两端封口，放入60℃水浴锅中恒温加热24 h。24 h之后取出毛细管，除去两端的橡胶垫片，以甲醇为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管色谱柱约1 h，除去床层内残留的致孔剂、未反应的单体以及反应生成的一些副产物，得到毛细管整体柱。截取20 cm毛细管整体柱，作为在线固相微萃取毛细管整体柱，待用。

1.5 固相微萃取整体柱截面形貌观察

从毛细管的填料端切下长约为2 cm的一段，用XL30ESEM电子扫描显微镜观察固相微萃取毛细管整体柱的截面形貌。

1.6 in－tube SPME－HPLC 系统的构建与运行

in-tube SPME-HPLC 系统结构参考文献［28］构建，采用双泵双六通阀系统，如图1所示：六通阀V1定量环位置（即1、4号位）为500 μL的定量PEEK管（聚醚醚酮管），六通阀V2的定量环位置（即1、4号位）为制备的毛细管整体柱；泵A与六通阀V1的6号位连接，泵B与六通阀V2的6号位连接，六通阀V1的5号位与六通阀V2的2号位相连。

联用系统运行流程：（1）实验开始时，六通阀V1处于Load状态，此时样品直接进入定量PEEK管。样品装载液（0.1%TFA 溶液-乙腈（98∶2，v／v））通过泵A，经过六通阀V1，平衡固相微萃取整体柱。六通阀V2处于Load状态，流动相通过泵B，以1.0 mL／min流速直接平衡液相色谱分析柱，以获得一个稳定的色谱分离基线。（2）进样完成后，开始富集清洗，六通阀V1由Load状态调为Inject状态，泵A与500 μL的定量PEEK管相通，泵A以0.04 mL／min流速将样品带入六通阀V2的固相微萃取整体柱。进样13 min后，六通阀V1重新调到Load状态，以样品装载液冲洗固相微萃取柱90 s，目的是消除固相微萃取柱中的水溶性杂质。（3）完成富集清洗后，将泵B的流速调为0.02 mL／min，六通阀V2由Load状态调为Inject状态后，用流动相以0.02 mL／min洗脱固相微萃取柱5 min，目的是将固相微萃取柱上富集的样品洗脱至分离柱中。洗脱结束后，将六通阀V2的状态重新调到Load状态，同时将泵B流速调为1.0 mL／min开始液相色谱分离检测。

图1 in－tube SPME－HPLC联用系统结构图Fig.1 Construction of in－tube SPME－HPLC

2 结果与讨论

2.1 固相微萃取整体柱的表征

2.1.1 固相微萃取整体柱截面形貌观察

图2是按1.4节的制备方法制得的固相微萃取整体柱截面的电镜图。由图2可以清楚地看出这种整体柱内部结构均匀且连续，具有相互贯穿的通孔结构，通透孔较大，大的通孔提供了较好的渗透性，有利于流动相的流动。此外，整体柱柱床和毛细管管壁结合紧密，没有产生裂缝。这说明整体柱与毛细管内壁键合良好。

2.1.2 固相微萃取整体柱的渗透性考察

本实验中，以甲醇为流动相，考察了在不同流速下固相微萃取整体柱的柱压降，以此表征整体柱的渗透性。当流动相（甲醇）流速从0.02 mL／min增加到0.06 mL／min时，整体柱的柱压降也相应从1.2 MPa线性提高到7.0 MPa，说明固相微萃取整体柱的渗透性良好。

图2 固相微萃取整体柱截面的电镜图Fig.2 Scanning electron microscope（SEM）photographs of the cross section of the SPME monolithic column

2.2 分离条件的选择

文献报道的测定苯氧羧酸类化合物的HPLC流动相体系主要有：乙腈-水体系［7］、乙腈-三乙胺水溶液（pH=10）体系［8］、甲醇-乙酸铵溶液体系［29］等。通过反复对比试验，本实验选择的流动相体系为0.1% （v／v）TFA 水溶液-乙腈（55∶45，v／v），其他条件为流动相流速1.0 mL／min，柱温30℃，检测波长为214 nm。在该条件下，5种苯氧羧酸类除草剂的分离效果较好，15 min内可完全分离。

2.3 in－tube SPME－HPLC 联用系统运行条件优化

固相微萃取毛细管整体柱长度、进样流速、进样时间、洗脱流速、洗脱时间等运行条件对in-tube SPME-HPLC联用系统检测都有影响，为了得到intube SPME-HPLC联用系统的最佳运行条件，我们对以上几个系统运行参数进行了考察。

2.3.1 固相微萃取毛细管整体柱长度的影响

在in-tube SPME-HPLC联用系统中，毛细管整体柱作为固相微萃取的介质，是整个联用系统的重要组成部分。固相微萃取介质量的多少直接影响到in-tube SPME-HPLC联用系统的萃取能力。实验中，以250 μm内径的毛细管制作固相微萃取整体柱，使用的整体柱越长则固相微萃取介质的量就越大，萃取能力就越强。由图3可以看出，保持其他条件不变，随着固相微萃取整体柱长度的增加，5种除草剂的峰面积不断增大。当整体柱长度大于20 cm以后，峰面积没有明显增大，考虑到随着使用的整体柱长度的增加，系统的柱压也不断增大，导致系统稳定性下降。因此，选用固相微萃取毛细管整体柱长度为20 cm。

图3 固相微萃取整体柱长度的优化Fig.3 Optimization of the length of the SPME monolithic column

2.3.2 进样流速的影响

在进样量不变的情况下，进样流速越大，则全部进样的时间越短。在保持进样量500 μL不变的前提下，考察了进样流速对5种除草剂峰面积的影响。由图4可知，进样流速越大，5种除草剂的峰面积越小。这是因为进样流速越大，样品在整体柱上的作用时间越短，保留下降。当流速大于0.04 mL／min时，5种除草剂的峰面积明显减小。当进样流速在0.02～0.04 mL／min时，5种除草剂的峰面积变化不大，但由于低的流速造成进样时间过长，导致实验效率不高。因此，选用 0.04 mL／min作为进样流速。

2.3.3 进样时间的影响

在保持进样流速不变的前提下，实验考察了进样时间对5种除草剂的峰面积的影响。由图5可知，进样时间越长，5种除草剂的峰面积越大。这是因为进样时间越长，样品的进样量越多，当进样时间小于13 min时5种苯氧羧酸类除草剂的峰面积随进样时间的增长而增大且变化趋势较大，但在进样时间大于13 min后5种苯氧羧酸类除草剂的峰面积随时间的变化不明显。说明样品在进样13 min后已接近完全进样。因此，选用13 min作为进样时间。

图4 进样流速的优化Fig.4 Optimization of sampling flow rate

图5 进样时间的优化Fig.5 Optimization of sampling time

2.3.4 洗脱流速的影响

为减少固相微萃取整体柱上所吸附杂质的洗脱并使联用系统更加稳定，本实验中以流动相作为洗脱液，洗脱富集在固相微萃取整体柱上的样品。在固定其他条件不变的情况下，考察了洗脱流速对5种除草剂的峰面积的影响。由图6可知：当流速小于0.02 mL／min时，5种分析物质的峰面积随流速增大逐渐增大，这是由于洗脱液体积增加使得分析对象洗脱得更充分；当流速大于0.02 mL／min时，5种分析物质的峰面积随流速增大有所下降，这可能是由于高的流速减少了洗脱液在固相微萃取整体柱上的作用时间，反而降低了洗脱能力。因此，选用的洗脱流速为0.02 mL／min。

图6 洗脱流速的优化Fig.6 Optimization of elution flow rate

2.3.5 洗脱时间的影响

在固定其他条件不变的情况下，考察了洗脱时间对这5种除草剂峰面积的影响。由图7可知，在洗脱时间小于5 min时，5种除草剂的峰面积随洗脱时间的增长而增大；当洗脱时间大于5 min以后，5种除草剂的峰面积没有明显变化。这表明当洗脱时间为5 min时，样品已接近完全洗脱。因此，选用的洗脱时间为5 min。

通过以上考察，我们得到了 in-tube SPMEHPLC联用系统最优运行条件：在线固相微萃取毛细管整体柱长度为20 cm，进样流速为0.04 mL／min，进样时间为 13 min，洗脱流速为 0.02mL／min，洗脱时间为5 min。

图7 洗脱时间的优化Fig.7 Optimization of elution time

2.4 方法验证

利用in-tube SPME-HPLC联用系统，我们对水样中添加的5种苯氧羧酸类除草剂进行了同步富集检测，对联用系统检测与直接进样检测进行了比较、并考察了5种苯氧羧酸类除草剂in-tube SPMEHPLC联用检测方法的工作曲线、检出限、回收率和重现性。

2.4.1 联用系统检测与直接进样检测比较

在处理后的水样中添加相同浓度的标准品后，我们进行了联用系统检测与直接进样检测的分离情况对比的实验。从图8可以清晰地看出，直接进样检测时，样品溶剂峰干扰大，样品区带展宽明显，造成分离对象峰形拖尾不对称，峰高下降，部分检测对象分离度无法满足检测要求；采用in-tube SPMEHPLC联用系统检测时，溶剂峰显著下降，各分析对象峰形对称，分离度较好，可以满足分离检测要求。通过计算两种情况下检测对象的峰面积比值，5种苯氧羧酸类除草剂的富集倍数分别为：3倍（PPA）、27 倍（2，2-CPPA）、27 倍（2，3-CPPA）、21 倍（2，4-D）和21倍（2，4-DP）。这说明相比直接进样，联用检测系统的检测灵敏度显著提高。

2.4.2 工作曲线与检出限

在最佳联用系统运行以及分离条件下，取不同浓度的空白加标水样进行工作曲线回归参数及检出限的测定。结果如表1所示：5种苯氧羧酸类除草剂在各自的线性范围内具有较好的线性相关性（R2＞0.99）；以信噪比为3时对应的质量浓度作为检出限，5种苯氧羧酸类除草剂的检出限均在10 μg／L以下，符合国内外相关标准［3，4］的检测要求。

图8 （a）直接进样检测与（b）联用系统检测的分离色谱图Fig.8 Chromatograms of（a）direct injection HPLC and （b）in－tube SPME－HPLC

表1 5种苯氧羧酸类除草剂的基质工作曲线与检出限Table 1 Matrix calibration curves and LODs of the five phenoxy acid herbicides

2.4.3 回收率

在联用系统最优条件下，通过向空白水样中准确加入不同浓度的5种苯氧羧酸类除草剂标准溶液，之后对样品进行前处理，并利用联用系统进行检测，以表征方法的回收率（n=5）。表2给出了各加标浓度的回收率结果：5种苯氧羧酸类除草剂的回收率在79.0%～98.0%之间，而相对标准偏差（RSD）≤3.9%。本方法成功应用于这5种苯氧羧酸类除草剂的同步富集检测，获得较为满意的结果。

2.4.4 重现性

在最佳分离条件下，以实际样品中的2，4-D的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）为例检验方法的重现性。2，4-D的日内保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.56%和1.83%，日间保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.93%和3.91%。这表明in-tube SPME-HPLC联用系统检测的重现性良好。

表2 空白水样品中5种苯氧羧酸类除草剂的回收率（n＝5）Table 2 Recoveries of the five phenoxy acid herbicides spiked in a blank water sample（n＝5）

2.5 实际样品测定

对取自两个地区的水样进行了检测，结果发现，除了2，4-D，未发现其他4种除草剂残留；2，4-D的残留量分别为 16.3 μg／L （厚美村）和 22.3 μg／L（浦口村）。

3 结论

以采用甲基丙烯酸十八烷基酯为功能单体制备的毛细管整体柱作为在线固相微萃取柱，构建在线管内固相微萃取-高效液相色谱联用系统，同步富集检测环境水样中的5种苯氧羧酸类除草剂（即2，4-二氯苯氧乙酸、苯氧丙酸、2-（2-氯）-苯氧丙酸、2-（3-氯）-苯氧丙酸、2-（2，4-二氯苯氧基）丙酸）。与HPLC系统直接进样对比，联用系统对5种苯氧羧酸类除草剂表现出优良的富集能力。该方法成功应用于水样中5种苯氧羧酸类除草剂的同步富集检测，获得了满意的结果，为相关农药的分析检测技术研究提供了科学参考和可行的实验思路。

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