分子印迹固相萃取－超高效液相色谱－串联质谱法测定猪肉中5种β2－受体激动剂残留

张学亮， 罗云敬*， 姜 洁， 路 勇， 冯 楠

（1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124；2.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100041）

β2-受体激动剂（β2-agonists）是一类人工合成的苯乙醇胺类药物，主要包含克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等，这类物质的作用包括显著提高动物胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率［1，2］，但对人体有毒害作用。因而，我国农业部等公告［3-6］规定严禁在动物饲料和饮用水等中使用此类药物，在动物源食品中不得检出此类药物，同时给出了部分药物的检测方法。欧盟等西方国家也对食品中部分β2-受体激动剂残留限量做出了规定［7］。

食品中β2-受体激动剂残留的常用检测方法有高效液相色谱法［8，9］、气相色谱-串联质谱法［10］、高效液相色谱-串联质谱法［11］、超高效液相色谱-串联质谱法［12-16］等。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）是人工合成的聚合物，是根据印迹分子定做的，具有特殊的分子结构和官能团，能选择性地识别印迹分子。所以以分子印迹聚合物为固相萃取吸附剂可提高萃取选择性。分子印迹固相萃取也逐渐得到很好的应用［15，16］，但是目前国内外尚未见采用分子印迹固相萃取结合液相色谱-串联质谱检测β2-受体激动剂残留的报道。本研究以猪肉为样品基质，在55℃酶解2 h后进行分子印迹固相萃取净化，内标法定量，建立了超高效液相色谱-串联质谱同时检测5种β2-受体激动剂残留的方法。本方法通过减少酶解时间提高了实验效率，而且采用内标法定量和分子印迹固相萃取柱进行净化，进一步提高了方法的准确性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC-TQ-S超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

苯乙醇胺 A（phenethylamine A）、沙丁胺醇（salbutamol）、沙美特罗（salmeterol）、克伦特罗（clenbuterol）、莱克多巴胺（ractopamine）、d6-沙丁胺醇（d6-salbutamol）、d5-莱克多巴胺（d5-ractopamine）、d6-克伦特罗（d6-clenbuterol）、d3-沙美特罗（d3-salmeterol）、d3-苯乙醇胺 A（d3-phenethylamine A）均购自 Dr.Ehrenstorfer GmbH；纯度均高于98.0%。β-盐酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶（30 ku／60 ku）购自默克公司；MIP Beta-Receptors固相萃取柱（25 mg／10 mL）购自美国 SUPELCO

标准储备液的配制：准确称取25 mg的上述标准品，用甲醇溶解在25 mL容量瓶中，配制成1 000 μg／kg的标准储备液，于-18℃保存。

乙酸-乙酸钠缓冲液的配制：称取43.0 g乙酸钠，加入22 mL乙酸，用水溶解并定容到1 000 mL，用乙酸调节pH到5.2。

1.2 样品制备

样品的酶解：准确量取动物性食品样品2 g，置于离心管内，加入1 mg／L的同位素标准溶液20 μL，涡旋混匀，加入 10 mL 0.2 mol／L 乙酸铵缓冲液（pH 5.2）和 100 μL β-葡萄糖醛酸酶／芳基硫酸酯酶，于55℃酶解2 h。酶解液放至室温后，用0.1 mol／L的NaOH溶液调pH至7.0左右，涡旋后于0℃、10 000 r／min下离心10 min，将上清液转入50 mL离心管中，待净化。

样品的净化：MIP柱依次用6 mL乙腈、1 mL水活化，然后提取液上MIP柱，弃去流出液；用3 mL水淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；再用1 mL乙腈、3 mL 60% （v／v）乙腈水溶液淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；用2 mL 1%（v／v）甲酸乙腈溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至近干，以流动相复溶后过0.22 μm的有机滤膜，待LC-MS测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1% （v／v）甲酸水溶液（B）／甲醇（A）。梯度洗脱：0～7.0 min，15%A～50%A；7.0～10 min，50%A～99%A；10～13 min，99%A；13.1～16 min，15%A。恒定流速：0.30 mL／min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源正离子（ESI+）模式；毛细管电压：2.59 kV；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流量：800 L／h；锥孔气流量：150 L／h；多反应监测模式。10种β2-受体激动剂的质谱分析参数见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱条件的优化

采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱分别对5种β2-受体激动剂进行多反应监测扫描，以两对母离子-子离子、保留时间等对这些化合物进行定性、定量。

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下的电保留时间和峰形外，还会影响分析物的离子化效率，从而影响目标化合物的检测灵敏度。本实验分别采用甲醇、乙腈、甲醇-0.1% （v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（v／v）甲酸水溶液作为流动相，考察了流动相组成对各化合物响应值的影响，结果表明甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液作为流动相时的峰形明显改善，因此以甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液为流动相。最终得到的5种β2-受体激动剂的总离子流图（total ion chromatogram，TIC）（见图1）。

表1 10种化合物的质谱参数Table 1 MS parameters for the ten compounds

图1 5种化合物的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms（TIC）of the five compounds

2.2 样品前处理方法的优化

食品中β2-受体激动剂检测中前处理方法的关键是选择提取效率好的提取溶剂，以及合理的净化方案，减少目标化合物在样品前处理过程中的损失。王培龙等［10］、胡艳云等［16］已经对提取溶液进行了很好的研究，本文就酶解条件、净化方式等条件进行了优化。

2.2.1 酶解条件的选择

β2-受体激动剂在动物体内代谢过程中，多数会与硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，最终以硫酸轭合物和葡萄糖醛酸轭合物等结合态形式存在，需要将其转化为游离态进行检测，因此采用β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶对样品进行酶解。参考Damasceno 等［17］、杨光等［18］对 β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶的活性研究，本文比较了55℃下酶解2 h和37℃下酶解16 h的效果。结果如图2所示，因此选择55℃下酶解2 h。在保证效率和回收率的前提下，本方法与王培龙等［10］、胡艳云等［16］方法以及国家标准［6］等酶解方法相比，提高了工作效率。

图2 酶解条件对5种β2－受体激动剂回收率的影响Fig.2 Effect of enzyme conditions on the recoveries of the five β2 －agonists

2.2.2 净化条件的优化

实验过程中发现，直接用提取剂提取而不净化时，提取溶液中样品基质干扰物质多，基质效应比较强，同时对色谱柱和仪器的损坏较大。样品基质中主要是大分子蛋白质和脂肪，另外也有小分子的碳水化合物等。实验比较了HLB柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MCX 柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MIP 柱和 DisQuE 净化管 （Waters，15 mL，150 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4），以回收率评价提取效果。如图3所示，对于DisQuE净化管、MCX柱、C18柱，由于目标化合物的种类多，极性差异比较大，化合物的保留效果差，损失较大，净化效果不理想；MIP柱作为相对比较专一的交换柱，能够特异性地保留目标化合物，采用低温环境净化（-4℃）和强酸条件也能起到沉淀蛋白质和脂肪的净化作用。所以选择MIP固相萃取柱。

图3 不同净化条件下5种β2－受体激动剂的平均回收率Fig.3 Average recoveries under different purification conditions for the five β2－agonists

2.3 方法的验证

2.3.1 标准曲线和检出限

用阴性样品基质配制 0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg／kg等不同含量的混合标准溶液，同时加入10 μL 1 mg／L的内标物混合液，进行样品前处理和测定。以5种β2-受体激动剂和内标物的响应比值为纵坐标，化合物的含量（单位为μg／kg）为横坐标绘制标准曲线。以信噪比为3确定方法检出限（LOD），信噪比为10确定定量限（LOQ）。5种β2-受体激动剂的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。

表2 5种β2－受体激动剂的回归方程、线性范围、相关系数（r2）、检出限和定量限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r2），LODs and LOQs of the five β2－agonists

2.3.2 回收率和精密度

如表3所示，在阴性猪肉空白样品中添加低、中、高3 个水平（0.25、1.0、5 μg／kg）的5 种 β2-受体激动剂混合标准溶液，样品前处理后测定目标化合物，每个加标水平进行6次试验。

表3 猪肉加标样品中5种β2－受体激动剂的平均回收率和相对标准偏差Table 3 Average recoveries and relative standard deviations ofthe five β2－agonists in spiked pork sample

按照实验室质量控制规范，当空白样品中加标水平低于0.1 mg／kg时，回收率和相对标准偏差的要求分别为60%～120%和0～20%。从表3的结果中可以看出，5种β2-受体激动剂的平均回收率为80.4% ～92.9%，相对标准偏差为1.2% ～6.3%，完全符合要求，方法的重现性和准确度良好，较为可靠。

2.4 实际样品的检测

利用上述方法对不同地区大型超市和市场购买的50份猪肉进行分析，只检出一份猪肉样品中含有0.13 μg／kg 克伦特罗（见图4）。

图4 阳性样品的色谱图Fig.4 Chromatogram of a positive sample

3 结论

本研究采用分子印迹固相萃取-超高效液相色谱-串联四极杆质谱技术建立了猪肉中5种β2-受体激动剂残留的同时定量方法。该方法检出限低、回收率高，快速、灵敏、准确，提高了实验效率和准确性，适合同时进行多种β2-受体激动剂残留的测定。

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