雌激素对不同年龄组帕金森病大鼠的影响及其机制

眭晨燕，李学忠，周小平，陈晓鹏

(江苏大学附属人民医院 神经内科，江苏 镇江 212000)



研究论文

雌激素对不同年龄组帕金森病大鼠的影响及其机制

眭晨燕，李学忠*，周小平，陈晓鹏

(江苏大学附属人民医院 神经内科，江苏 镇江 212000)

目的探讨雌激素(E2)对鱼藤酮诱导的不同年龄组帕金森病(PD)大鼠模型的影响及其机制。方法将24月龄SD大鼠(高龄组)和12周龄SD大鼠(低龄组)分别分为对照组(0.9%氯化钠溶液)、鱼藤酮处理组(鱼藤酮2 mg/kg)、雌激素治疗组(鱼藤酮2 mg/kg和E2 1 mg/kg)和他莫昔芬处理组(鱼藤酮2 mg/kg、E2 1 mg/kg和他莫昔芬1 mg/kg)，用行为学测试观察大鼠运动功能改变，免疫组织化学法及Western blot检测TH及LC- 3表达，高效液相色谱-电化学检测仪(HPLC-ECD)检测纹状体单胺类递质的变化。结果1)鱼藤酮显著缩短高龄大鼠转棒潜伏期，延长爬杆时间(P<0.05)，雌激素减弱鱼藤酮作用，他莫昔芬减轻雌激素作用。2)鱼藤酮显著减少高龄组黑质TH 阳性细胞数和TH表达(P<0.05)，雌激素逐渐恢复TH 阳性细胞损失和TH表达，他莫昔芬减轻雌激素作用。3)鱼藤酮增加LC- 3表达(P<0.05)，雌激素和他莫昔芬对其表达影响不大。4)鱼藤酮显著降低DA及其代谢产物DOPAC含量(P<0.05)，升高5-HT含量，高龄组更明显(P<0.05)，雌激素减弱鱼藤酮作用，他莫昔芬减轻雌激素作用。5)鱼藤酮增加自噬体的数量，雌激素增加自噬溶酶体/自噬体的比例。结论高龄大鼠PD模型更可靠，雌激素通过促进自噬成熟对鱼藤酮诱导的大鼠PD模型产生明显的治疗作用。

雌激素；帕金森病；年龄；自噬

帕金森病(Parkinson disease，PD)主要病理变化是中脑黑质-纹状体多巴胺能神经元变性、丢失。PD细胞模型予以适当浓度的雌激素(estrogen，E2)可有效减少细胞损伤，促进黑质神经元的存活，机制之一在于通过ERK途径调节自噬，促进自噬成熟。为E2有望成为消除脑老化和治疗神经变性疾病的候选药物提供了重要的依据[1]。然而对于腹腔注射E2对不同年龄组PD动物模型起到治疗的特点和机制尚不够明确，本研究旨在采用腹腔注射给药对E2作用于鱼藤酮诱导的PD大鼠模型产生的影响及其机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼藤酮、雌激素、鼠抗β-actin抗体、他莫昔芬、兔抗LC- 3抗体和HPLC-ECD标准品(Sigma公司)；Bradford BCA(Pierce公司)；兔抗TH抗体和HRP标记的抗大鼠IgG(Chemicon公司)；HRP标记的抗兔IgG及化学发光底物LumiGLO(Cell Signaling Technology公司)；RIPA蛋白抽提液(申能博彩公司)；抗兔生物素ABC试剂盒和DAB显色试剂盒(Vector公司)；HPLC级甲醇(英国BDH实验室)；其余均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和处理：雄性12周龄SD大鼠40只，平均体质量250 g，24月龄大鼠40只，平均体质量500 g[SPF级 上海西普尔BK实验动物有限公司提供 合格证号：SCXF(沪)2013- 0007]。80只大鼠随机分为8组:分别为低龄组(young)4组和高龄组(old)4组，每组10只。对照组(con)：0.9% NaCl溶液1.5 mL；鱼藤酮处理组(R)：鱼藤酮溶液1.5 mL(2 mg/kg)；雌激素治疗组(R+E)：鱼藤酮溶液0.75 mL(2 mg/kg)，雌激素0.75 mL(1 mg/kg)；他莫昔芬处理组(R+E+T)：鱼藤酮溶液0.5 mL(2 mg/kg)，雌激素0.5 mL(1 mg/kg)，他莫昔芬注射液0.5 mL(1 mg/kg)；腹腔注射时，以2 mL注射器刺破腹部皮肤，缓慢推注液体，共3 d。在最后1次注射后8 d处死动物，断头取脑。一半冰上快速分离大鼠中脑，分离中脑腹侧约1 mm×1 mm×1 mm组织块用于电镜观察，剩余部分左侧用于Western blot；右侧用于免疫组织化学染色；一半冰上快速分离大鼠纹状体用于HPLC-ECD法检测单胺类递质改变。

1.2.2 行为学检测：分别在造模前、后第3天对各组大鼠进行行为学评定。所有行为学检测均在一恒温、固定布局、安静并光照充分的房间进行。并固定由两名实验者进行，一人负责仪器操作，另一人负责记录。1)转棒耐力检测：转棒速度为8周/分，将大鼠置于直径15 cm的旋转圆棒上，记录大鼠被置于棒上至跌落的时间(潜伏期)，每只大鼠重复测3次，每次间隔5 min，取平均值。测试前每只大鼠进行2次适应性训练。2)爬杆检测：测试前引导大鼠自杆顶爬下至桌面两次，测试时将大鼠头端向下置于杆顶(注意杆子用绳子缠好，保证有足够的摩擦力)，记录大鼠由50 cm高度爬至杆底平面的时间，每只大鼠测3次，每次间隔5 min，取平均值，爬杆稍倾斜，角度80°。

1.2.3 免疫组织化学染色：冰上快速取出中脑组织后固定于4%多聚甲醛+2%蔗糖中4～6 h，然后浸于30%蔗糖中待组织块沉底后，OCT包埋后冰冻切片机行中脑连续冠状切片，层厚5 μm，采用ABC(avidin biotin-peroxidase complex)法染色，按说明书操作，显微镜观察拍照。

1.2.4 Western blot检测：取同等重量左侧中脑组织。1)蛋白抽提：取组织冰上按100 mg∶1 mL加入RIPA溶液，匀浆(5 s×7次)，冰上静置30 min，4 ℃，2 000 r/min离心30 min，弃沉淀，取上清液，混匀，-20 ℃保存备用。2)蛋白印迹：取各组蛋白质10 μg，行SDS-PAGE电泳；电转膜，5%脱脂奶粉封闭后加入稀释好的一抗TH、β-actin、LC- 3抗体；4 ℃孵育过夜，次日分别加入二抗，室温孵育1 h后行化学发光法显示结果。3)图象扫描与灰度测定：扫描底片后，用IMAGE J图像程序分析软件分析免疫印迹蛋白条带灰度值，两组间目的蛋白条带与同一样品β-actin的比值进行比较。

1.2.5 高效液相色谱-电化学检测仪(HPLC-ECD)检测单胺类递质：取分离的同等重量纹状体组织，加入100 μL的0.1 mol/L的高氯酸制成匀浆(8.0 microns，10 s，3次)，12 000 r/min，4 ℃离心，2次取上清液，上液相系统，检测NE、E、DA、DOPAC、HVA 和5-HT的含量。用BASChrom Graph 115101 色谱控制分析系统进行数据分析。

1.2.6 透射电镜检查：取中脑腹侧约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，放入4%戊二醛中；4%戊二醛及1%锇酸双重固定。丙酮逐级脱水，树脂包埋。LKB-1型切片机做超薄切片，厚度为50 nm。柠檬酸铅染色；透射电镜观察SD大鼠纹状体神经元中自噬体的形成和溶酶体激活、摄片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 动物的行为学检测

所有鱼藤酮注射大鼠第2天即有捕捉时反抗动作减少的现象，并逐渐出现主动活动减少，动作迟缓，全身抖动，嗜睡；皮毛及尾巴伸直，弓背状姿势等PD症候群特征。随着注射天数增加活动减少程度加重。高龄组出现肌肉震颤，四肢僵直等类PD症状；毛色逐渐发黄、变脏、有竖毛现象；其中部分大鼠还出现阵挛性惊厥，全身肌紧张、匍匐、呼吸急促。低龄组则未见明显肌肉颤动和惊厥表现，并且在最后1次注射后3 d开始运动能力缓慢好转，自主活动明显增多。但高龄组大鼠在最后1次注射后运动能力进一步下降，2周也未见明显好转。鱼藤酮明显缩短高龄组转棒潜伏期，延长爬杆时间(P<0.05)；雌激素减弱鱼藤酮毒性作用，表现为转棒潜伏期延长，爬杆时间缩短(P<0.05)；他莫昔芬减弱雌激素作用，表现为爬杆时间明显延长(P<0.05)。爬杆时间高龄组明显慢于低龄组；部分大鼠甚至时常从杆上滑落(表1)。

表1 不同年龄和干预对大鼠行为学的影响

*P<0.05 compared with con group;#P<0.05 compared with R group;ΔP<0.05 compared with R+E group.

2.2 TH和LC- 3的表达

1)免疫组织化学染色结果：鱼藤酮明显降低高龄组TH阳性细胞数(P<0.05)，雌激素治疗后TH阳性细胞增多(P<0.05)，但少于对照组(P<0.05)，他莫昔芬减轻雌激素作用(P<0.05)(图1，表2)。2)Western blot结果：鱼藤酮显著减少TH表达(P<0.05)，雌激素处理增加TH表达(P<0.05)。他莫昔芬减轻雌激素作用，高龄组更明显(P<0.05)。鱼藤酮明显增加LC- 3表达(P<0.05)，雌激素和他莫昔芬对LC- 3表达影响不大(图2，表3)。同低龄组相比，高龄组中脑黑质区域神经元明显减少，较低龄组对鱼藤酮更敏感，更易受损，雌激素的保护作用更明显，他莫昔芬减轻雌激素作用。

2.3 纹状体单胺类递质的改变

低龄组单胺类递质基础水平比高龄组高，提示神经递质水平可能发生随龄性下降，或者高龄组代谢水平偏低；多巴胺(dopmaine，DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(3,4-hydroxy-phenylacetic acid，DOPAC)

TH positive neurons per high power field图1 不同年龄和干预对中脑黑质神经元的影响Fig 1 Effect of different age and intervention on substantia nigra neurons(scale bar=100 μm)

图2 不同年龄和干预对大鼠中脑TH和LC3表达的影响Fig 2 Effects of different ages and intervention on the expression of TH and LC- 3 rats

表2 不同年龄和干预对中脑黑质神经元的影响Table2 Effectofdifferentageandinterventiononsub⁃ stantianigraneurons(THpositiveneuronsper highpowerfield，x±s，n=5)group numberofTHpositivecellsyoungcon695±65R494±63R+E594±53R+E+T543±64oldcon587±59R236±47∗R+E445±57∗#R+E+T323±46∗Δ∗P<005comparedwithcongroup；#P<005comparedwithRgroup；ΔP<005comparedwithR+Egroup．表3 不同年龄和干预对大鼠中脑TH和LC3表达的影响Table3 Effectsofdifferentagesandintervention ontheexpressionofTHandLC⁃3rats (x±s，n=5)group banddensity(TH/β⁃actinprotein)banddensity(LC⁃3/β⁃actinprotein)youngcon079±012041±011R042±011∗072±013∗R+E061±011﹟073±012∗R+E+T052±009∗067±014∗oldcon075±013033±009R014±011∗078±014∗R+E051±011∗#072±015∗#R+E+T037±009∗#Δ071±023∗∗P<005comparedwithcongroup；#P<005comparedwithRgroup；ΔP<005comparedwithR+Egroup．

在鱼藤酮处理后出现明显下降(P<0.05)，高龄组更明显，雌激素处理降低下降幅度，他莫昔芬减轻雌激素作用。5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)在鱼藤酮处理后升高，高龄组更明显(P<0.05)，雌激素处理降低升高幅度，他莫昔芬减轻雌激素作用。去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)则无明显改变(表4)。提示高龄组较低龄组对鱼藤酮更敏感，更易受损，雌激素的保护作用更明显。

2.4 年龄和鱼藤酮对SD大鼠黑质神经元自噬成熟的影响以及雌激素的保护作用

低龄组神经元核膜完整，染色质结构正常，线粒体形态分布正常，未见自噬体，溶酶体数量未见增多；鱼藤酮处理后，染色质边集，自噬体形成，溶酶体数量有所增多；少许线粒体肿胀变形，大部分嵴结构尚完整，雌激素处理后自噬溶酶体增多，自噬溶酶体/自噬体比例上升，但不明显。高龄组神经元核膜完整，染色质有边集，线粒体形态正常，数量减少，溶酶体数量较低龄组增多；鱼藤酮处理后，自噬体迅速增加，少见自噬溶酶体，溶酶体数量有所增多；线粒体肿胀空化，嵴少，雌激素处理后，自噬体数量减少，自噬溶酶体数量增多，自噬溶酶体/自噬体比例明显增加，他莫昔芬减轻雌激素作用(图3)。提示鱼藤酮可促使自噬体形成和溶酶体数目增加，线粒体受损。雌激素处理后自噬体数量减少，自噬溶酶体/自噬体比例明显增加，大部分线粒体形态趋于正常。

3 讨论

PD是一种老年人常见病。85岁以上老年人中“轻度帕金森样症状”的出现率高达50%。更有人提出，所谓的正常老化已经包括了很多神经变性疾病的临床前病理进程[2]， 这就显示出老化和PD之间存在着密切联系。本研究利用行为学检测方法，对24月龄和12周龄SD大鼠在选择性DA能神经毒性物质鱼藤酮处理前、后的运动功能变化作了系统观察。并研究雌激素(estrogen，E2)对不同年龄大鼠保护作用及作用机制。

表4 不同年龄和干预对大鼠纹状体单胺类递质含量的改变

*P<0.05 compared with con group;﹟P<0.05 compared with R group;△P<0.05 compared with R+E group.

arrowhead.autophagosomes; arrow.autolysosomes图3 透射电镜观察不同因素处理对大鼠黑质神经元的影响

研究发现24月龄大鼠对鱼藤酮耐受性较低，运动功能障碍更明显，且运动障碍代偿能力低。但E2在低龄鼠的保护作用不如高龄鼠明显，可能由于低龄鼠体内E2的基础水平高于高龄鼠，同样剂量的E2对高龄鼠的影响相对较大。为进一步探讨行为学变化的病理基础，了解DA代谢状况，本研究对纹状体单胺类递质检测结果发现鱼藤酮减少DA及其代谢产物DOPAC含量，E2治疗后DOPAC含量升高，与对照组无明显差异。是否这种递质的含量变化就一定与对DA能神经元的治疗作用相平行？答案可能是否定的[3]。而黑质TH阳性细胞数亦表现出随龄性减少。一般认为，黑质TH阳性神经元的多少可以反映黑质DA能神经元的水平。暴露于鱼藤酮后，24月龄大鼠TH阳性细胞数下降程度更明显，与行为学观察结果相一致，即相同剂量的鱼藤酮在高龄个体产生更为明显的病理学损害和行为学改变[4]。研究表明，高龄个体血-脑脊液屏障通透性增加，线粒体功能发生衰退以及氧化应激持续增高[5]，导致其对鱼藤酮高度易感，从而产生更为严重的类PD症候群。

流行病学研究发现PD在男性中发生率较高，E2可以使女性PD患者在运动效应中获益[6]。自噬水平正常可以保护细胞抵御不良刺激，自噬异常导致疾病的发生。溶酶体功能和自噬效率发生随年龄性下降，为老年人中PD发生率较高提供了一定的理论依据[7]。自噬触发受MAPK/ERK 和P38 信号途径调节。ERK途径与自噬成熟相关[8]。E2及其受体参与MAPK/ERK信号调控。本研究发现老化和鱼藤酮均诱导黑质神经元内自噬体形成和溶酶体数量增加，E2治疗后自噬体与溶酶体融合增多，自噬溶酶体/自噬体比例增高。研究发现E2的神经保护作用是与MAPK/ERK信号途径的激活有关，在阿尔茨海默病中，E2激活MAPK/ERK信号途径，减少β-淀粉样蛋白沉积，介导神经保护和认知修复功能[9]。在PD细胞实验中E2能通过介导ERK的磷酸化调节自噬途径来抑制SHSY5Y细胞自噬性死亡[10]。本研究发现E2虽未能明显上调LC- 3的表达，但促进自噬体转化为自噬溶酶体，上调自噬溶酶体/自噬体的比例，促进自噬成熟，减少多巴胺能神经元的损害。

本实验通过鱼藤酮构建不同年龄组大鼠PD模型，然后腹腔注射E2对其进行治疗和机制进行了系统的研究，从行为学、DA代谢和形态学方面探讨了老化作为PD危险因素在该病的发生发展中起重要作用，提示高龄大鼠更适合制作PD模型；同时进一步证实了E2通过调节自噬，促进自噬成熟，从而促进多巴胺能神经元的存活。

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Effects of estrogen on rats of different age groups with Parkinson’s disease and its mechanisms

SUI Chen-yan, LI Xue-zhong*, ZHOU Xiao-ping, CHEN Xiao-peng

(Dept.of Neurology, the Affiliated People’s of Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000,China)

Objective To investigate the effect of estrogen(E2) on different age rat groups of Parkinson’s disease(PD) models induced by Rotenone and its mechanism.Methods 24-month-old SD rats(high age group)and 12-week-age SD rats(low age group)were divided into control group (saline), Rotenone treatment group(Rotenone 2 mg/kg), Estrogen treatment group(Rotenone 2 mg/kg and E2 1 mg/kg)and Tamoxifen treatment group(Rotenone 2 mg/kg, E2 1 mg/kg and Tamoxifen 1 mg/kg). Behavior tests were carried out to observe the change of movement function, Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the changes of TH and LC- 3.HPLC-ECD was used to detect possible changes of monoamine neurotransmitters in striatum. Results 1)Rotenone reduced significantly old age rat’s rotarod latencies and prolonged the climbing pole time(P<0.05). E2 ameliorated this effect, Tamoxifen reduced the effect of E2. 2)Rotenone significantly reduced the number of TH positive cells in high age rats(P<0.05), E2 partly restored TH positive cell loss, Tamoxifen reduced this effect of E2, so did the expression of TH protein. 3)Rotenone increased the expression of LC- 3(P<0.05), E2 did not affect the expression of LC- 3, so did Tamoxifen. 4)Rotenone significantly decreased the level of DA and its metabolite DOPAC(P<0.05), elevated the level of 5-HT especially in old rats(P<0.05). E2 downregulated the influence, and Tamoxifen reduced the effect of E2. 5)Rotenone increased the number of autophagosomes, but E2 increased the proportion of autolysosomes/autophagosomes. Conclusions Old age rat PD model was more reliable. Estrogen promoted autophagy mature, and had obvious therapeutic effect on rat PD model induced by rotenone.

estrogen;Parkinson’s disease;age;autophagy

2015- 03- 02

2015- 07- 03

镇江市社会发展项目(SH2014049)

1001-6325(2015)10-1351-07

R741

A

*通信作者(corresponding author)：sudalxz@163.com