人参皂苷Rg1缓解D-半乳糖致衰老大鼠脾损伤

张 晶，邵 月，张力恒，冉瑞图，孙嘉政，张岩岩，贾道勇，张梦思，王亚平

(重庆医科大学 干细胞与组织工程研究室 组织胚胎学教研室， 重庆 400016)



研究论文

人参皂苷Rg1缓解D-半乳糖致衰老大鼠脾损伤

张 晶，邵 月，张力恒，冉瑞图，孙嘉政，张岩岩，贾道勇，张梦思，王亚平*

(重庆医科大学 干细胞与组织工程研究室 组织胚胎学教研室， 重庆 400016)

目的探讨人参皂苷Rg1对D-半乳糖致衰老大鼠脾组织结构与功能的影响及其机制。方法SD大鼠随机分为正常对照组、衰老模型组(D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d)、Rg1干预组(建模，第15 天起Rg1 20 mg/kg,qd×28 d)、Rg1对照组(0.9%氯化钠注射液+Rg1)。取脾脏测定脾指数，石蜡切片观察脾脏显微形态，β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测脾细胞衰老，CCK-8检测脾细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖能力，ELISA检测IL- 2、IL- 6和晚期糖基化终产物(AGEs)含量，流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)，酶法检测丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量，Western blot检测细胞衰老相关蛋白P53、P21及Rb的表达。结果与衰老模型组比较，Rg1干预组大鼠脾指数、脾脏白髓面积比及脾细胞增殖能力提高(P<0.05)；脾细胞分泌IL- 2、IL- 6水平和SOD活性明显增强(P<0.01)；脾细胞的SA-β-Gal阳性率、ROS和MDA含量下降(P<0.01)；AGEs 下降(P<0.05)；P53、P21及RB蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论人参皂苷Rg1能缓解D-半乳糖致衰大鼠脾损伤，其机制可能与抑制氧化损伤和下调P53-P21-RB信号通路有关。

人参皂苷Rg1；衰老模型；脾脏；大鼠

人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人参重要的药效成分，可调控衰老及延缓造血干细胞衰老[1]。免疫系统的主要细胞起源于造血干细胞，推测人参皂苷Rg1可以延缓免疫系统衰老，调控免疫细胞的功能。脾脏是机体最大的免疫器官，在免疫功能调控中具有重要作用。本研究探讨人参皂苷Rg1对D-半乳糖致衰大鼠脾结构与功能的影响及其机制，为寻找延缓免疫系统衰老的天然药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

3月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体质量180～200 g，[重庆医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(渝)2007- 0001]。人参皂苷Rg1(吉林宏久生物技术有限公司，纯度≥98.6%)；D-半乳糖和ConA(Sigma公司)；IL- 2和IL- 6检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；RPMI- 1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclon公司)；CCK- 8试剂盒(上海七海复泰生物公司)；SA-β-Gal染色试剂盒、ROS与MDA试剂盒(碧云天生物技术研究所)； AGEs 试剂盒(上海源叶生物技术有限公司)；P53、P21和RB兔抗鼠多克隆抗体(Prointech公司)；羊抗兔二抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠衰老模型复制与给药[2- 3]:将大鼠随机分为4组，每组10只。正常对照组：注射0.9%氯化钠溶液qd×42 d；衰老模型组：皮下注射D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d；Rg1干预组：注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg/kg,qd×28 d；Rg1对照组：注射等量0.9%氯化钠溶液qd×14 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1干预组)。

1.2.2 脾指数测定与形态学观察:药物注射后第2 天称大鼠体质量(kg)，取脾脏称湿重(mg)，测定脾指数[脾指数=脾脏湿重(mg)/体质量(kg)]。常规石蜡切片，HE染色，连续切片显微镜下观察，以Image J 软件计算脾白髓占脾组织切片的比例。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色检测脾细胞衰老:制备脾脏冷冻组织切片，按试剂说明书进行SA-β-Gal酶染色[3]，光镜下观察分析，计算各组大鼠衰老脾细胞百分比。

1.2.4 CCK- 8检测脾细胞增殖能力:制备脾单细胞悬液[4]，每孔5×103细胞 /200 μL 接种于96孔板中，每孔加终浓度5 mg/L的ConA，分别培养0、1、2、3和4 d，各孔加10 μL CCK- 8，450 nm波长酶标仪测定吸光度值(A值)。

1.2.5 ELISA检测脾细胞分泌IL- 2及IL- 6水平:按1.2.4方法制备和培养脾细胞，培养48 h，收集培养上清液，按照试剂盒说明书检测各组上清液中IL- 2及IL- 6含量。

1.2.6 ELISA检测血清中晚期糖基化终产物(AGEs)含量:采取外周血，4 ℃过夜后收集血清，2 500 r/min×20 min，离心2次，吸上清液，按ELISA检测试剂盒说明书检测血清中AGEs含量。

1.2.7 流式细胞术及酶法检测细胞氧化及抗氧化能力:收集1.2.4制备的各组脾细胞，加入1 mL DCFH-DA，37 ℃ 孵育 25 min，培养液洗涤细胞3次，流式细胞术检测脾细胞内ROS水平，以 DCF的平均荧光强度表示其含量。收集培养上清液，酶法检测SOD与 MDA的含量。

1.2.8 Western blot检测衰老相关蛋白:提取各组脾细胞总蛋白，调整蛋白浓度40 μg/泳道，12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，P53、P21和RB一抗(均1∶200)、β-actin抗体(1∶4 000)4 ℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，洗膜，ECL发光系统显色。用FluorSTM Multimager 图像分析仪，Quality-One4.11软件进行图像灰度扫描。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人参皂苷Rg1对衰老大鼠脾指数与组织形态学的影响

衰老模型组脾脏指数明显下降(P<0.01)，Rg1干预组能显著增加脾指数(P<0.05)(表1)。衰老模型组白髓与红髓界限模糊，白髓面积比显著下降(P<0.01)， Rg1干预组大鼠脾白髓面积比增加(P<0.05)(表1，图1)。

表1 各组大鼠的脾指数及白髓面积比

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

图1 各组大鼠脾脏的组织形态 Fig 1 Spleen structure in each group (×100)

2.2 人参皂苷Rg1对衰老大鼠SA-β-Gal染色阳性脾细胞影响

脾细胞胞质呈蓝色为SA-β-Gal阳性细胞，着色深浅与着色面积同脾细胞衰老程度呈正相关。衰老模型组阳性细胞数显著增多(P<0.01)，Rg1干预组阳性细胞数明显减少(P<0.01)(图2，3)。

图2 各组大鼠脾脏SA-β-Gal染色结果Fig 2 SA-β-Gal staining positive splenocytes in each group(×200)

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group图3 各组大鼠SA-β-Gal染色阳性脾细胞数量比较Fig 3 SA-β-Gal staining positive splenocytes

2.3 人参皂苷Rg1对衰老大鼠血清中晚期糖基化终产物(AGEs)含量的影响

衰老模型组的AGEs含量显著增加(P<0.05)；Rg1干预组能显著降低血清AGEs含量(P<0.01)(表2)。

表2 各组大鼠血清中AGEs含量比较

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

2.4 人参皂苷Rg1对衰老大鼠脾细胞增殖能力的影响

衰老模型组大鼠脾细胞对ConA刺激的增殖能力明显降低(P<0.05)；Rg1干预组大鼠脾细胞对ConA刺激的增殖能力增强(P<0.05)(图4)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group图4 各组大鼠脾细胞增殖能力比较Fig 4 Proliferative rate of splenocytes in each

2.5 人参皂苷Rg1对衰老大鼠脾细胞分泌IL- 2和IL- 6水平的影响

衰老模型组大鼠脾细胞分泌IL- 2和IL- 6水平明显降低(P<0.01)；Rg1干预组大鼠脾细胞分泌IL- 2和IL- 6水平回升(P<0.01)(表3)。

2.6 人参皂苷Rg1对衰老大鼠脾细胞产生活ROS、SOD及MDA水平的影响

衰老模型组大鼠脾细胞产生ROS、MDA水平显著升高(P<0.01)，SOD 活性显著下降(P<0.01)；Rg1干预组大鼠脾细胞产生ROS、MDA水平明显降低(P<0.01)，SOD 活性显著升高(P<0.01)(表4)。

表3 各组大鼠脾细胞分泌IL- 2和 IL- 6水平比较

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

表4 各组大鼠脾细胞产生活ROS、SOD与MDA水平比较

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

2.7 人参皂苷Rg1对衰老大鼠脾细胞表达P21、P53及RB蛋白的影响

正常对照组P21、P53及RB蛋白低表达，衰老模型组P21、P53及Rb蛋白表达上调(P<0.01)，Rg1干预组脾细胞中P21、P53及RB蛋白表达量有所降低(P<0.01)(表5，图5)。

表5 各组大鼠脾细胞P53、P21及RB蛋白表达

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

1.normal control group；2.Rg1 control group；3.aging model group；4.Rg1 intervention group图5 各组大鼠脾细胞P53、P21及RB蛋白条带Fig 5 P21、P53 and RB protein bands in each group

3 讨论

本实验探究Rg1对D-半乳糖致衰大鼠脾结构与功能影响，从抗氧化损伤和调控P53-P21-RB信号通路两方面研究Rg1缓解脾损伤及脾衰老的机制。

本研究采用D-半乳糖致大鼠衰老模型，发现大鼠脾指数、脾脏白髓面积比、脾细胞对ConA作用的增殖能力及分泌IL- 2、IL- 6水平均明显下降，SA-β-Gal染色阳性率增加，提示D-半乳糖建立的衰老模型可导致大鼠脾脏结构与功能损伤，可用于免疫器官衰退相关生物学研究[5- 6]。

脾指数是代表脾脏大体形态的重要指标，而脾脏白髓是脾脏组织学的实质结构。Rg1明显减轻脾脏萎缩程度，提高脾指数和脾脏白髓面积比例，提示Rg1能拮抗D-半乳糖对脾脏结构的破坏。研究脾细胞的功能状态能有效反映脾脏功能。Rg1可提高脾细胞对ConA刺激的增殖能力和分泌IL- 2及IL- 6水平，减少SA-β-Gal染色阳性率及AGEs积聚，提示Rg1能缓解D-半乳糖诱导的脾细胞衰老，促进脾细胞增殖，激活脾细胞功能。

细胞内ROS水平增加和抗氧化能力下降是导致细胞衰老的关键因素[7]。ROS可作用于脂质发生过氧化反应，产生MDA，其具有细胞毒性；还可作为细胞信号传导和基因表达调控分子，对细胞增殖分化、细胞凋亡和细胞衰老具有调控作用[8- 9]。机体中SOD能有效清除生物氧化产生的超氧阳离子自由基[10]。本实验证明， Rg1可明显减少脾细胞产生ROS和MDA水平，显著提升SOD的活性，表明Rg1可能通过抑制D-半乳糖所致的氧化损伤，延缓大鼠的脾衰老。

P53-P21-Rb是重要的细胞衰老信号传导通路，抑癌基因P53的激活可上调P21的表达，从而抑制CDK2/Cyclin E复合物的活性，阻止细胞从G1期向S期转变[11- 12]。P21是一种细胞周期抑制蛋白，可通过抑制细胞CDK2 和CDK4 的活性，进而抑制Rb和转录因子(E2F)的磷酸化过程，诱导细胞生长停滞[13]。本实验发现，人参皂苷Rg1能显著降低衰老大鼠脾细胞P53、P21及RB蛋白的表达，推测Rg1可以下调P53-P21-RB衰老信号通路，这可能是Rg1缓解大鼠脾衰老或损伤机制之一。

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高龄产妇胎儿出现先天性异常概率未必增高

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该研究刊登于新一期母体与胎儿医学会年会(Annual meeting of the Society of Maternal-Fetal Medicine)。

Ginsenoside Rg1 relieves the injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose

ZHANG Jing, SHAO Yue, ZHANG Li-heng, RAN Rui-tu, SUN Jia-zheng, ZHANG Yan-yan,JIA Dao-yong, ZHANG Meng-si, WANG Ya-ping*

(Dept. of Histology and Embryology, Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the spleen structure and function of aging rats and its relative mechanism.Methods Forty SD rats were randomly divided into normal control group, aging model group (D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d), Rg1 intervention group(D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d and Rg1 20 mg/kg, from day 15th,qd×28 d) and Rg1 control group. After finishing injections the spleen index was measured, paraffin sections were then made to observe spleen microscopic structure. Senescence-associated β-Galactosidase(SA-β-Gal) stain was used to detect aging splenocytes. The proliferative capacity of splenocytes stimulated with Concanavalin A (ConA) was measured by CCK- 8. The content of IL- 2,IL- 6 and advanced glycosylation end products(AGEs) was detected by ELISA. The level of ROS was analyzed by flow cytometry(FCM). Malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD) were detected by enzymatic assay. The expression of senescence-associ-ated protein P53,P21 and RB were detected by Western blot analysis. Results Comparing the Rg1 intervention group with the aging model group, spleen index, splenic white pulp area proportion, the proliferative capacity of splenocytes were significantly increased (P<0.05);The secretory capability of IL- 2 and IL- 6, the active content of SOD were obviously increased(P<0.01);The percentage of SA-β-Gal positive splenocytes, the productions of ROS and MDA were significantly decreased (P<0.01);The production of AGEs was decreased (P<0.05);The expressions of P53,P21 and Rb were also significantly down-regulated (P<0.01).Conclusions Ginsenoside Rg1 relieves injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose.It is suggested that the mechanism may be Rg1 inhibiting oxidative stress and down-regulating P53-P21-RB signaling pathway.

ginsenoside Rg1; aging model; spleen; rat

2015- 03- 19

2015- 05- 27

国家自然科学基金(30973818)；国家教育部博士导师基金(20125503110006)；重庆医科大学学生创新基金(201314)

1001-6325(2015)10-1308-06

R392.5

A

*通信作者(corresponding author)：ypwangcq@aliyun.com