响应面法优化复合酶酶解草鱼蛋白工艺

黄　艳，谢三都，许艳萍

（1.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300；2.福建师范大学 闽南科技学院，福建 泉州 362332）

响应面法优化复合酶酶解草鱼蛋白工艺

黄艳1，谢三都2，许艳萍2

（1.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300；2.福建师范大学 闽南科技学院，福建 泉州 362332）

摘要：在单因素实验基础上，选取料液比、酶解pH、酶解时间、复合酶添加量为自变量，游离氨基态氮含量为响应值，应用Box-Benhnken设计和响应面法，研究各自变量及其交互作用对酶解效果的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，在酶解温度为50℃的条件下，确定最佳酶解工艺为：料液比25∶100（g/mL），酶解pH 6.28，复合酶（m风味蛋白酶∶m木瓜蛋白酶=2∶1）添加量0.8%，酶解时间5 h。在此条件下，酶解液中的平均氨基态氮含量为4.265 g/L。与理论预测值4.291 g/L相比，其相对误差为0.61%。说明通过响应面优化后得出的回归方程预测值较为准确。

关键词：草鱼蛋白；复合酶解；响应面法

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）俗名鲩鱼，是淡水鱼中大宗养殖的品种之一，其性温味甘，具有暖胃和中、平肝祛风、益肝明目等功效[1]。目前草鱼仍以鲜销为主[2]，少数用于加工（以初加工为主，附加值低）。在我国，草鱼现有的主要加工产品有冷冻产品、干制品、腌熏制品、罐头制品及鱼糜制品等，加工水平与发达国家相比存在较大差距[3]。因此，开展草鱼深加工技术的研究具有重要的经济价值。

目前，以氨基酸为主要原料的产品越来越受人们的青睐，如氨基酸饮料、复合氨基酸胶囊、调味品等[4-5]。我国氨基酸类调味品主要是以豆类发酵生产获得，在发达国家，利用多种来源的动物水解蛋白开发的调味品在整个调味品市场中已占有相当大的比例，因此，开发以动物蛋白为主的氨基酸类高档调味品是调味品发展的主要趋势之一[6]，但国内在这方面的研究相对比较少。

草鱼蛋白作为优质动物蛋白之一，富含人体所需的各种必需氨基酸[7]。将鱼肉蛋白水解成氨基酸的方法主要有酸水解法、碱水解法和酶解法。酸解和碱解属于传统的蛋白水解方法，虽简单价廉，却易造成环境污染[8]，且酸法水解会生成氯丙醇等有毒物质[9]，且水解程度较难控制。酶解能在温和条件下进行，能在一定条件下进行定位水解产生特定的肽，且水解进程易于控制[10]。目前国内外对低值鱼类蛋白酶解利用方面做了不少的研究，但对草鱼蛋白的酶解工艺研究却鲜见报道，因此，本实验以草鱼肉为原料，选取风味蛋白酶和木瓜蛋白酶构成复合酶，研究各酶解条件对草鱼蛋白酶解效果的影响，并通过响应面法优化草鱼蛋白的酶解工艺，以期为今后草鱼鱼肉蛋白资源的酶法利用及其新产品开发提供基础研究资料。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

原料及预处理：草鱼购于农贸市场，去除头尾、内脏、骨、鱼鳞及鱼皮，取肉切成小块，绞成肉糜，18℃冻藏备用。

试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、甘氨酸、氢氧化钠、酚酞、甲醛（36%-38%）等均为国产分析纯。

酶制剂：风味蛋白酶（酶活力40 000U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力600 000U/g）、碱性蛋白酶（酶活力20 000U/g）、菠萝蛋白酶（酶活力80 000 U/g）均购于广西南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶（酶活力50 000 U/g），购于河南金润食品添加剂有限公司出品。

1.2仪器与设备

101-1AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；PL602-S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电子精密天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；雷磁pHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；78-1型磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；台式离心机TDL-40B：上海安亭科学仪器厂；DS-1型组织捣碎机：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限医疗设备厂；YQ-12型绞肉机：广州麦森厨具有限公司。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程

草鱼预处理→解冻→称取一定质量的草鱼肉糜→不同条件下酶解→灭酶（85℃，10 min）→冷却→离心 （6 000 r/min，15 min）→收集上清液→测定游离氨基态氮含量。

1.3.2游离氨基态氮含量的测定

采用甲醛滴定法[11]进行测定。

1.3.3复合酶比例选取及单因素试验

1.3.3.1复合酶比例的选取

在预实验中，选取风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶共5种酶，研究它们对草鱼蛋白酶解效果的影响，发现风味蛋白酶的酶解效果最好，并能降低酶解液中的苦味，考虑各蛋白酶的最适酶解温度和pH，本试验选用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶构成复合酶进行草鱼蛋白的酶解研究。

设定风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例分别为1∶1、1∶2、2∶1，在酶解pH7.0，温度50℃，加酶量1%（按鱼肉质量计，下同）及料液比20∶100的条件下对草鱼肉蛋白酶解3 h，再灭酶、离心，测定酶解液中的游离氨基态氮含量。

1.3.3.2单因素对草鱼蛋白酶效果的影响

以酶解液中的氨基态氮含量为评价指标，考察料液比、酶解pH值、加酶量、酶解时间及酶解温度对草鱼蛋白酶解效果的影响。

1.3.4响应面法优化试验[12-15]

在草鱼蛋白酶解的单因素试验基础上，考虑复合酶的最适温度在50～55℃，对氨基态氮含量的影响相差基本不大，因此选取料液比、酶解时间、加酶量、酶解pH值为主要因素，每个因素分别设置3个水平，分别以-1、0、1表示，以游离氨基态氮含量为响应值，按照Design-Expert7.1.3软件设计的方案进行试验，以期获得草鱼蛋白的最佳酶解工艺。

1.3.5数据分析

利用Design-Expert7.1.3软件对实验数据进行二次多项回归拟合、方差分析、显著性检验和响应面分析。

2　结果与分析

2.1复合酶比例的确定及单因素试验结果

2.2.1复合酶比例对草鱼蛋白酶解效果的影响

图1　复合酶比例对草鱼蛋白酶解效果的影响

由图1可知，在相同酶解温度、酶解pH值和酶解时间作用条件下，当风味蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为2∶1时，草鱼蛋白酶解液中游离氨基态氮含量为2.735 g/L，明显高于试验设定的其它比例。因此，后续酶解试验的复合酶比例均选用2∶1。

2.2.2料液比对草鱼蛋白酶解效果的影响

在酶解温度为50℃、酶解pH7.0及加酶量为1.0%的条件下，以不同的料液比10∶100、15∶100、20∶100、25∶100、30∶100对草鱼肉蛋白各酶解3 h，其对应酶解液中的氨基态氮含量如图2所示。

图2　不同料液比对草鱼蛋白酶解效果的影响

由图2可知，料液比为20∶100时对应的酶解液中游离氨基态氮含量最大，达2.725 g/L。料液比较低时，由于溶液的稀释作用致使酶与鱼肉蛋白接触机率下降而导致酶解效果较差；料液比大于20∶100时，鱼肉中的酸碱度可能破坏缓冲液稳定性，导致pH值改变，酶活性降低而使酶解效果变差。

2.2.3酶解pH值对草鱼蛋白酶解效果的影响

在酶解温度为50℃、料液比为20∶100及加酶量为1.0%的条件下，以不同的酶解pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0对草鱼肉蛋白各酶解3 h，其对应酶解液中的游离氨基态氮含量如图3所示。

图3　不同酶解pH值对草鱼蛋白酶解效果的影响

酸碱度对酶促反应的影响非常大，过高或过低的pH值都会明显抑制酶的活性，甚至会导致酶失活。从图3可以看出，pH6.0～7.0是复合酶促反应较适宜的酸碱范围，且当pH为6.5时，酶解效果最佳，游离氨基态氮含量达到最大值为2.785 g/L。

2.2.4加酶量对草鱼蛋白酶解效果的影响

在料液比为20∶100、酶解pH7.0及酶解温度为50℃的条件下，以不同的加酶量0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%对草鱼肉蛋白各酶解3 h，其对应酶解液中的游离氨基态氮含量如图4所示。

图4不同加酶量对草鱼蛋白酶解效果的影响

酶促反应过程中，一般酶解效果随着加酶量的增加而增强，当加酶量增加至饱和状态时酶解效果会趋于稳定，但复合酶之间因可能存在相互影响而使酶活力受到抑制，进而影响游离氨基态氮的生成[16]。由图4可知，当复合酶量增加至1.0%时，游离氨基态氮含量达到最高值，为2.730 g/L；但继续增加酶用量，游离氨基态氮含量并未趋于平衡而呈下降趋势，说明复合酶之间存在相互影响。

2.2.5酶解时间对草鱼蛋白酶解效果的影响

在料液比为20∶100、酶解pH7.0、酶解温度为50℃及加酶量为1.0%的条件下，对草鱼肉蛋白分别酶解1、2、3、4、5、6 h，其对应酶解液中的游离氨基态氮含量如图5所示。

图5不同酶解时间对草鱼蛋白酶解效果的影响

由图5可知，随着酶解时间的延长，草鱼蛋白酶解液中游离氨基态氮含量逐渐增加，酶解时间达到4 h时，其含量为2.800 g/L，继续延长酶解时间，游离氨基态氮含量并未继续增加而呈下降趋势，最终趋于平衡。这与酶解体系中底物浓度有关，当酶解时间达到4 h时，体系中底物的浓度极低或几乎被酶解，继续延长时间，游离氨基态氮含量亦不会再增加。

2.2.6酶解温度对草鱼蛋白酶解效果的影响

在料液比为20∶100、酶解pH7.0及加酶量为1.0%的条件下，分别在不同的温度45、50、55、60、65℃下草鱼肉蛋白酶解3 h，其对应酶解液中的游离氨基态氮含量如图6所示。

图6不同酶解温度对草鱼蛋白酶解效果的影响

温度对酶活性影响而使复合酶促反应结果呈现典型的钟型曲线，随温度的升高，酶促反应效果先上升，达到最高点后又迅速下降。由图6可知，此复合酶酶促反应效果的最高点在50℃，此时酶解液中游离氨基态氮含量为2.72 5 g/L。

2.2响应面法试验结果与分析

在单因素试验基础上，采用Box-Benhnken设计，以游离氨基态氮含量为响应值进行响应面优化，试验结果如表1所示。

2.2.1回归方程的建立

采用Design-Expert7.1.3软件对表1中草鱼蛋白酶解的响应面值进行多元回归拟合，得到草鱼蛋白酶解效果（游离氨基态氮含量，Y，10 g/L）与料液比、酶解时间、加酶量及缓冲液pH的二项多元回归方程：

Y=0.33+0.024A+0.033B+0.020C-0.047D-1.750×10-3AB-0.021AC-2.875×10-3AD-0.023BC+7.125×10-3BD+5.250× 10-3CD+1.738×10-3A2+0.015B2-4.500×10-4C2-0.042D2

表1　草鱼蛋白酶解的响应面试验设计与结果

该方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度，系数的正、负反映了影响的方向[17]。由于该方程的二次项系数均为负值，可以推断方程代表的抛物面开口向下，因而具有极大值点，可以进行优化分析[18]。

2.2.2方差分析

对实验建立的响应模型进行方差分析，所得结果如表2所示。

表2　回归模型方差分析

由表2可知，方程模型的F值是8.87，P<0.001，说明回归方程模型的差异具有高度统计学意义，该方程可以代替试验点对试验结果进行分析；而失拟差P 为0.119 1＞0.05，差异不具有统计学意义，即模型与实验值的差异较小；R2Adj=0.797 5，说明该模型能解释79.75%响应值即草鱼蛋白酶解效果的变化[19]；相关系数R2=0.898 7，说明该模型拟合程度较好，对试验结果干扰很小。因此，该模型可以用于草鱼蛋白酶解效果的分析。

2.2.3回归方程系数的显著性检验

对回归方程各系数的显著性进行检验，所得结果如表3所示。

表3　回归方程系数显著性检验

由表3可知，在一次项和二次项中均有显著性因素。一次项B、D达到极显著水平，A达到高度显著水平，C达到显著水平；二次项D2达到极显著水平。比较一次项系数的F值和P值，可知各因素对草鱼蛋白酶解效果的影响程度大小顺序为：酶解pH值＞酶解时间＞料液比＞加酶量。

2.3草鱼蛋白酶解效果的响应曲面分析

响应面图形是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲面图，从中可以直观形象的看出最佳参数以及各参数之间的相互作用。当响应面分析图为山丘形曲面时，有极大值存在；当响应面分析图为山谷形曲面时，有极小值存在；当响应面分析图为马鞍形曲面时，无极值存在[20]。如果响应面坡度非常陡峭，表明响应值对于各因素的改变非常敏感；如果响应面坡度相对平缓，表明试验指标可以忍受各因素的变异，而不影响到响应值的大小[21]。

图7时间和料液比对游离氨基态氮含量的影响

图8加酶量和料液比对游离氨基态氮含量的影响

图9 pH和料液比对游离氨基态氮含量的影响

图10 pH值和时间对游离氨基态氮含量的影响

图11 pH值和加酶量对游离氨基态氮含量的影响

图12加酶量和时间对游离氨基态氮含量的影响

图7显示，延长酶解时间有利于酶解液中游离氨基态氮含量的增加，当酶解时间大于4 h，则更有利于草鱼蛋白的酶解；游离氨基态氮含量随料液比的增大逐渐增加后趋于平缓。图8显示，当加酶量处于较低水平时，酶解液中的游离氨基态氮含量随料液比的增大而大幅度升高，当加酶量＞1.0%时，随料液比的增加，游离氨基态氮含量的增幅大为降低或接近平缓。加酶量对草鱼蛋白的酶解影响与料液比相似。图9显示，当pH值保持不变时，料液比对酶解液中的游离氨基态含量影响不大；而料液比保持不变时，游离氨基态氮含量随pH值的增大而升高，当达到最高点后则呈下降趋势。当酶解pH值为6.5，料液比为20∶100时，酶解液中的游离氨基态氮含量最高。图10显示，当pH值保持不变时，游离氨基态氮含量随时间的延长而增加；当时间保持不变时，游离氨基态氮含量随pH值的增加先升高，达最高点后下降。当酶解时间为5 h，酶解pH值为6.5时，更有利于草鱼蛋白酶解。图11显示，当加酶量不变时，缓冲液pH值≤6.5时，酶解液中的游离氨基态氮含量随酶解pH值增加而升高；pH值＞6.5时，游离氨基态氮含量则呈下降趋势。当酶解pH值保持不变时，加酶量对草鱼蛋白酶解液中的游离氨基态氮含量的变化影响不显著。图12显示，当加酶量处于较低水平时，游离氨基态氮含量随酶解时间的延长逐渐升高；当加酶量处于较高水平时，游离氨基态氮含量随时间的延长先下降后升高，时间≥4 h时更有利于草鱼蛋白的酶解。

在酶解温度为50℃的条件下，采用Design-Expert7.1.3对响应结果分析获得复合酶解草鱼蛋白的最佳工艺是：加酶量为0.8%，料液比为25∶100，pH值为6.28，酶解时间为5 h。在该条件下，氨基态氮含量的理论值为4.291 g/L。根据上述优化条件进行试验结果的验证，重复3次，实际测得的氨基态氮含量分别为4.262、4.254、4.283 g/L，平均氨基态氮含量为4.265 g/L。与优化前的单因素最优值2.785 g/L相比，氨基态氮含量提高了53.14%。与理论预测值相比，其相对误差约为0.61%，表明由响应面法分析获得的最佳参数，可靠性较高，具有一定的实践指导意义。

3　结论与讨论

选取风味蛋白酶和木瓜蛋白酶构成复合酶，考察复合酶比例对草鱼蛋白酶解效果的影响，确定复合酶酶解的最佳比例为2∶1。通过单因素试验和应用Box-Behnken中心组合设计及响应面分析法对草鱼蛋白酶解工艺进行优化，拟合了料液比、复合酶添加量、酶解pH值、酶解时间这4个因素对草鱼蛋白酶解液中的游离氨基态氮含量的回归模型，经验证实验证明该模型合理可靠，能较好地预测草鱼蛋白酶解液中的游离氨基态氮含量。通过模型系数显著性检验，得到因素的主次关系为：酶解pH值＞酶解时间＞料液比＞加酶量。在酶解温度为50℃的条件下，由该模型确定的最佳工艺条件为料液比25∶100，复合酶添加量0.8%，酶解pH 6.28，酶解时间5 h。在此条件下，测得草鱼蛋白酶解液中的平均氨基态氮含量为4.265 g/L，与预测理论值4.291 g/L的相对误差为0.61%。该研究结果可为草鱼鱼肉蛋白酶解液制备成氨基酸、调味品等产品提供一定的理论指导，为草鱼鱼肉蛋白的深加工利用开辟一条新途径。

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（责任编辑：叶丽娜）

中图分类号：TS254.4

文献标识码：A

文章编号：1674-2109(2015)12-0021-07

收稿日期：2015-08-23

作者简介：黄艳(1984-)，女，汉族，讲师，主要从事天然产物的提取与应用、农产品贮藏与加工研究。

Optimization of Composite Enzymatic Hydrolysis Process of Grass Carp Protein by Response Surface Methodology

HUANG Yan1，XIE Sandou2，XU Yanping2

（1.Schoo1 of Tea and Food Science，Wuyi University，Wuyishan，Fujian 354300；
2.Minnan Science and Techno1ogy Institute，Fujian Norma1 University，Quanzhou，Fujian 362332）

Abstract:Four hydro1ysis parameters inc1uding so1id-1iquid ratio,pH,hydro1ysis time and compound enzyme dosage were optimized using Box-Benhnken design and response surface methodo1ogy based on sing1e-factor experiments for achieving maximum content of amino nitrogen.The interaction of the respective variab1es and their inf1uence on hydro1ysis resu1t were studied and the simu1ated quadratic po1ynomia1 regression equation of prediction mode1 was set up.Under the condition of hydro1ysis temperature 50℃,the optimum hydro1ysis techno1ogy was so1id-1iquid ratio 25∶100(g/mL),pH6.28,compound enzyme dosage of 0.8%(mass ratio of f1avor proteinase and pawpaw proteinase=2∶1)and hydro1ysis time of 5h.Under these conditions,the average content of amino nitrogen was 0.004 265 g/mL. Compared to the theoretica1 va1ue,the re1ative error was 0.61%.Optimized by response surface regression equation derived some practica1 significance.

Key words:grass carp protein;composite enzymatic hydro1ysis;response surface methodo1ogy