支原体巨噬细胞活化脂肽-2诱导人单核细胞分泌MMP-9

李媛媛 余敏君 游晓星 李冉辉 陈列松 朱翠明 文道林 曾焱华

支原体巨噬细胞活化脂肽-2诱导人单核细胞分泌MMP-9

李媛媛 余敏君 游晓星 李冉辉 陈列松 朱翠明 文道林 曾焱华

目的 观察支原体巨噬细胞活化脂肽-2（MALP-2）对人单核细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的影响。方法 体外培养人单核细胞系THP-1，分别采用0、0.1、1.0和5.0 μg/mL MALP-2刺激THP-1细胞12～18 h，采用实施定量PCR检测MMP-9 mRNA的表达，荧光共振能量转移（FRET）检测MMP-9的酶活性变化，ELISA检测培养上清中MMP-9的含量。结果 THP-1细胞未刺激时，MMP-9的mRNA表达量、酶活性以及分泌水平极低。当给予0.1～5.0μg/mL MALP-2作用18 h后，MMP-9的分泌水平显著增高，细胞培养上清液中MMP-9的酶活性也明显增强。此外，5.0μg/mL MALP-2刺激THP-1细胞6 h后即可诱导MMP-9 mRNA表达，16 h后达到峰值。结论 MALP-2可诱导人单核细胞表达MMP-9，这可能是支原体感染早期重要的致病因素。

支原体巨噬细胞活化脂肽-2；基质金属蛋白酶-9；单核细胞

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物。目前已明确的对人类致病的支原体主要包括肺炎支原体（Mycoplasma. pneumoniae）、生殖支原体（M. genitalium）、人型支原体（M. hominis）等[1-3]。研究表明，支原体感染后所致的炎症反应主要与其细胞膜上的膜脂蛋白有关。支原体膜脂蛋白N末端的二酰甘油半胱氨酸结构是活化单核、巨噬细胞的基础[4]。巨噬细胞活化脂肽2（macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）是根据支原体膜脂蛋白二酰甘油半胱氨酸结构人工合成的一种脂肽，它几乎所有支原体膜脂蛋白的免疫刺激活性，因此被广泛应用于支原体感染以及各种免疫机制相关研究[5-6]。支原体感染后可活化单核、巨噬细胞，并诱导其分泌一系列炎症相关介质，如细胞因子、趋化因子、活性氧类、前列腺素、一氧化氮等分子。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs)是一类能降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的酶类。多种因素可诱导MMPs的表达，如细胞因子、生长因子等。微生物感染后，可诱导单核细胞趋化至感染部位并分泌多种MMPs，从而参与炎症反应、组织重构、血管发生和伤口愈合。在所有的MMPs中，以MMP-9最重要。研究显示，MMP-9的分泌与气道高反应性有关，在哮喘和阻塞性肺疾病中，MMP-9的水平显著增高。这表明MMP-9可能与呼吸道炎症反应密切相关，但迄今为止缺乏支原体感染与MMP-9的相关报道。本研究通过体外实验观察MALP-2对人THP-1单核细胞分泌MMP-9的影响，探讨支原体潜在的致病机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 RPMI-1640培养基、胎牛血清、Trizol试剂为Invitrogen产品；FastStart Essential DNA Green Master购自Roche。人MMP-9 ELISA检测试剂盒购自深圳欣博盛生物有限公司。MMP-9酶活性检测试剂盒购自AnaSpec（SensoLyte® 490 MMP-9 Assay Kit）。

1.2 细胞培养与处理 人单核细胞系THP-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，于37℃，5% CO2条件下培养。待细胞生长密度达到视野的80%时，将其接种至24孔板中（细胞数约5×105），加入终浓度为0、0.1、1.0和5.0 μg/mL MALP-2刺激18 h，或用5.0 μg/mL MALP-2刺激0～36 h，随后获取上清用于下一步研究。

1.3 MMP-9 mRNA水平分析 采用实时定量PCR（Real-time PCR）检测MMP-9 mRNA的表达。细胞经MALP-2孵育结束后，用Trizol试剂提取细胞总RNA并测量其浓度。取2 μg RNA用于Real-time PCR分析。设计MMP-9和GAPDH引物，并由上海生工合成。MMP-9引物序列分别为：5’-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3’(正向)和5’-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3’（反向）；GAPDH：5’-AGGGCTGCTTTTAAC TCTGGT-3’(正向)和5’-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3’。反应条件是： 94℃3 min，然后94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，总共40个循环（LightCycle @96）。所得数据与内参GAPDH之比作为相对值。

1.4 MMP-9酶活性检测 细胞经MALP-2刺激完毕后，获取培养上清，采用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）间接法测定MMP-9的酶活性。其原理为MMP-9可降解底物FRET peptide，从而使DabcylPlusTM无法淬灭荧光分子EDANS，后者可通过激化荧光而检测到，其荧光强度与MMP-9的活性成正比。具体操作根据AnaSpec公司提供的试剂盒操作步骤进行。在荧光酶标仪（Synergy HT,Bio-Tec）上测定其强度（激发/发射波长分别为340和490 nm），并计算各组与对照组的比值（相对活性）。

1.5 MMP-9分泌检测 细胞处理结束后，通过反复冻融以裂解细胞。经1000 r/min离心5 min后，弃沉淀，采用双抗体夹心ELISA法检测上清中MMP-9的含量。操作方法按照深圳欣博盛生物有限公司提供的试剂盒操作步骤进行。结果以相对含量表示（处理组吸光值/对照组吸光值×100%）。

1.6 统计学方法 所有实验数据重复3次，应用

SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分析数据，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度MALP-2诱导THP-1细胞分泌MMP-9 THP-1细胞基础状态下MMP-9分泌水平极低。当给予0.1、1.0、5.0 μg/mL MALP-2作用18 h后，可显著诱导THP-1细胞分泌MMP-9，且随着MALP-2浓度的增加，MMP-9的分泌水平进一步增多。见图1。

图1 不同浓度MALP-2对THP-1细胞分泌MMP-9的影响注：与对照组（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

2.2 MALP-2诱导THP-1细胞表达MMP-9 mRNA MALP-2处理THP-1细胞16 h后，也可上调细胞内mRNA的表达。当MALP-2浓度为5.0 μg/mL时，MMP-9 mRNA表达水平增加了4.3倍。见图2。

图2 不同浓度MALP-2对MMP-9 mRNA表达的影响注：与对照组（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

2.3 MALP-2作用不同时间对THP-1表达MMP-9的影响 MALP-2作用THP-1细胞6 h后即可上调MMP-9 mRNA表达，随着时间的延长，mRNA表达水平逐渐增高，16 h后达到峰值，并持续高表达至36 h。见图3。

2.4 不同浓度MALP-2对MMP-9活性的影响 THP-1细胞未刺激时，培养上清液中MMP-9酶活性很低。经不同浓度MALP-2作用后，MMP-9酶活性随着MALP-2浓度的增加而逐渐增强。见图4。

3 讨论

MMPs是一类Zn2+依赖性的肽链内切酶，可降解组织中的ECM。MMPs根据其结构可分为4个不同的功能区，分别为疏水信号肽区、催化区、前肽区、羧基末端区和铰链区。其中前肽区和酶催化活性区结构非常保守，但各种MMPs又具有不同的功能，如，不同的MMPs对底物具有专一性，但也非绝对[7]。同一种MMPs可降解多种ECM，而某些特定的ECM又可被多种MMPs降解。尽管如此，不同MMPs对同一ECM的降解效率也有所不同。MMPs家族根据底物特异性和结构相似性可大致分为胶原酶、间质溶解素、明胶酶、基质溶解因子和膜型金属蛋白酶[8]。其中明胶酶主要包括MMP-2和MMP-9，两者主要降解IV/V型胶原。研究表明，MMP-2和MMP-9广泛表达于白细胞、气道上皮细胞、血管内皮细胞以及肿瘤细胞等。MMP-2通常为组成性表达，而MMP-9为诱导型。在各种感染性疾病、炎症反应、血管病变和恶性肿瘤的发生过程中，MMP-9表达往往上调表达[9-10]。

图3 MALP-2作用不同时间对MMP-9 mRNA表达的影响注：与对照组（0 h）相比，aP＜0.05

图4 不同浓度MALP-2对MMP-9酶活性的影响注：与对照组（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

研究表明，MMPs参与了支原体感染后的发病过程。Baluk等[11]研究发现，鼠支原体感染大鼠肺组织中MMP-2和MMP-9含量显著增高，但该过程与血管重构无关。随后Peltier[12]的研究也表明，鼠肺炎支原体感染妊娠期大鼠后，羊水中前MMP-9的分泌也显著增高。此外，肺炎支原体所致的社区获得性肺炎患者血清中MMP-9的含量也明显高于正常人群[13]。目前国内外的研究多集中在支原体感染动物模型或肺炎患者体内MMPs水平的检测及，而对于体外研究较少。本实验通过体外培养人单核细胞，采用支原体的病原相关分子模式MALP-2对MMP-9的分泌情况进行观察，结果显示，THP-1细胞未经MALP-2处理时，MMP-9 mRNA的表达水平、培养上清中MMP-9的分泌情况及酶活性较低。而当单核细胞与MALP-2作用后，上清中MMP-9的浓度显著增高，与临床肺炎支原体感染患者外周血中MMP-9变化趋势抑制。Real-time PCR也证实MALP-2刺激细胞6 h后即可上调其mRNA表达水平，并持续至36 h。MMP-2的表达同时也伴随有酶活性的增高。本研究采用荧光共振能量转移原理对MMP-9的酶活性进行观察，结果也发现，随着MALP-2浓度的增加，酶活性逐渐增强，与ELISA检测结果一致。

总之，支原体MALP-2能诱导并促进人单核细胞表达MMP-9，从而参与对ECM的降解。随着ECM的广泛降解，在感染早期会使更多的白细胞渗出至感染部位，或者促进支原体进一步扩散，从而加剧局部组织的破坏，促进疾病的发生发展。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.29.002

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