TB-DNA、分枝杆菌快速培养和T-SPOT.TB及联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值

牟向欣

TB-DNA、分枝杆菌快速培养和T-SPOT.TB及联合检测对结核性脑膜炎的诊断价值

牟向欣

目的 探讨TB-DNA、分枝杆菌快速培养和T-SPOT.TB对结核性脑膜炎(tuberculosis meningitis TBM简称“结脑”)的诊断价值。方法 回顾性分析了2012年3月～2014年11月已确诊的106例初治结脑患者脑脊液（cerebrospinalfluid,CSF）的TB-DNA、分枝杆菌快速培养及T-SPOT.TB检测结果，并收集了45例非结脑的CSF作为对照组，对结果进行比较分析。结果 结脑组的TB-DNA、分枝杆菌培养、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝杆菌快速培养联合检测的检测方法的敏感性分别为23.1%、21.8%、80.9%和45.5%，在非结脑组中其特异性分别为100%、100%、88.9%和100%。结论 T-SPOT.TB敏感性最高，TB-DNA+分枝杆菌培养联合检测也可以提高检出率，为结脑早期诊断及治疗提供有效的辅助检查依据。

TB-DNA；BD 960分枝杆菌快速培养；T-SPOT.TB；脑脊液

结核性脑膜炎(tuberculosis meningitis TBM，简称“结脑”)是神经系统结核病最常见的类型，发病率约占全身结核的

6%，由于其早期诊断困难，延误率和死亡率均较高，尤其是北方边远山区发病率甚高，是结核病死亡的主要原因[1]。由于脑脊液（celebrospinalfluid，CSF）涂片的阳性率仅为10%，因而需要一个结脑临床诊断更客观实用的依据。本研究收集了2012年3月2014年11月共106例临床已确诊的结脑初治患者，通过回顾分析这些结脑患者的TB-DNA、BD 960分枝杆菌快速培养、T-SPOT.TB的检测结果，进而探讨这几种检测方法对结脑的诊断价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 结核性脑膜炎组 本研究106例患者全部为辽宁省锦州市传染病医院结核区2012年3月～2014年11月住院治疗且诊断明确的结脑患者。入选标准参考Skinner等和Ahuja等的临床诊断标准：（1）急性、亚急性或隐匿性起病，多伴有头痛、发热、呕吐等脑膜刺激症状或伴有局灶性神经损害体征；（2）CSF的常规和生化均有淋巴细胞比例增加、蛋白定量逐渐升高等特异性改变。（3）CT或MRI检查表现为脑水肿、肉芽肿或渗出。（4）抗结核药物治疗有效。其中男67例，女39例，年龄5～64岁，且12例有脑外结核原发灶，5例抗酸菌涂片阳性。经抗结核治疗，好转或治愈者97例，9例死亡。

1.1.2 非结核性颅内感染组 为2013年12月～2014年11月在锦州市中心医院神经内科住院治疗的非结核性脑膜炎患者，共45例，男31例，女14例；年龄12～75岁。根据相应诊断标准，病毒性脑膜炎25例，化脓性脑膜炎18例，新型隐球菌性脑膜炎2例。

1.2 仪器与试剂 （1）TB-DNA检测方法：仪器为杭州博日科技有限公司的荧光定量PCR检测系统Bioer LineGene 9620，试剂为杭州博奥生物有限公司提供的晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法，产品编号为301031），CSF标本经核酸提取、加入扩增液等步骤采用PCR和TaqMan探针技术快速完成结核和非结核分枝杆菌的鉴别诊断（具体步骤详见仪器及试剂操作说明书）。（2）分枝杆菌快速培养：仪器为美国BD公司的BACTEC MGIT BD 960分枝杆菌快速培养仪，培养基为美国BD公司的MGIT液体培养基，CSF标本按操作流程在生物安全柜内直接接种于MGIT培养管中，然后置入BD 960分枝杆菌培养仪中，仪器报警阳性后，将阳性培养管取出直接涂片进行抗酸染色以确定是否为分枝杆菌。（3）T-SPOT.TB检测方法：试剂盒T-SPOT.TB和单个核细胞分离管由深圳达科为生物技术有限公司提供，实验过程严格按照试剂盒说明书操作进行，结果判定依据斑点数，0～5个为阴性，标本A和B斑点数-阴性对照斑点数≥6个为阳性。

1.3 方法

1.3.1 对106例结脑患者进行回顾性资料收集，其中有78例进行过CSF的TB-DNA检测，55例进行过CSF的分枝杆菌培养实验，47例进行过CSF的T-SPOT.TB检测，其中有44例同时进行过TB-DNA和分枝杆菌培养实验。

1.3.2 对45例非结脑对照组的CSF同时进行三项检测（仪器、试剂及方法同上述106例）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.00软件进行数据计算与分析，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结脑患者CSF中的TB-DNA、分枝杆菌快速培养、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝杆菌培养联合检测结果如表1所示。TB-DNA、分枝杆菌快速培养、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝杆菌快速培养联合检测的敏感性分别为23.1%、21.8%、80.9%和45.5%。T-SPOT.TB敏感性最高，对CSF TB-DNA阳性或阴性的敏感性分别为91.5%、75.7%，对CSF 结核菌培养阳性或阴性的敏感性分别为92.3%、80.7%，差异均无统计学意义。对照组中，45例中有3例化脑患者的CSF是T-SPOT.TB阳性，特异性为88.9%，其余特异性均为100%，相比较差异无统计学意义。见表1。

表1 4种方法检测结果

3 讨论

T-SPOT.TB技术是2001年由Lalvani［2]等发明，利用结核杆菌感染患者外周血或脑脊液单个核细胞中特异性活化T细胞，这些单个核T细胞在受到结核杆菌特异性抗原刺激后分泌干扰素-γ而设计的T细胞试验，通过计数斑点可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的T细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。此项技术可以从60×103个分泌干扰素-γ的T细胞中检测到一个细胞［3]。随着这一技术的不断完善和发展，在结核病诊断方面，T-SPOT.TB技术不止应用于外周血，在脑脊液、胸腹水［4-5］等标本的检测也取得了满意效果。Kim等[6]于2007年在韩国率先对结核性脑膜炎患者的脑脊液及外周血进行T-SPOT.TB检测，以明确其敏感性及特异性，结果脑脊液的敏感性及特异性均为75%，本次各组CSF试验结果经比对，T-SPOT.TB敏感性为最高，为80.9%（38/47），特异性为88.9%，略高于Kim等的报导，但低于国内相关报导[6]。其中有脑外结核原发灶的12例标本T-SPOT.TB皆为阳性。由此可看出，T-SPOT.TB有较高的灵敏度和特异性，对临床结脑特别是初发患者，具有较高的应用价值，只是由于成本较高致费用偏高，不适合作为筛查必检项目在临床普及。

PCR技术也是近年来广泛应用于临床的检测手段，特别是其高敏感性、高特异性和快速性备受临床认可，可检出少量菌、异质和异型菌，特别是CSF标本的TB-DNA检测，当CSF中的TB涂片和分枝杆菌培养为阴性时，若TB-DNA为阳性也可为临床提供结脑的诊断依据，并可区分结核和非结核分枝杆菌，且特异性好于T-SPOT.TB技术。本文单一检测CSF中的TB-DNA和分枝杆菌快速培养的敏感性分别为23.1%（18/78）和21.8（12/55），相对较低，和以往关于CSF中的TB-DNA检测的研究[7-8]有差异，可能主要是本次研究的病例都为结脑初治患者，只有9例患者病情较重，其他患者病情都相对较轻，CSF抗酸菌涂片只有5例阳性，由于CSF中结核菌含量本来就偏少，致TBDNA检测和分枝杆菌快速培养的敏感性偏低。但若两项联合检测，则敏感性可以提高到45.5%（20/44），且特异性很好，对结脑的临床诊断和鉴别诊断也有一定的临床价值。

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Objective To discuss the diagnosis value of TB-DNA、Mycobacterium rapidly develop、T-SPOT.TB and the combination in tubercular meningitis(TBM). Methods To analyse retrospecively the test results of TB-DNA、Mycobacterium rapidly develop and T-SPOT.TB of CSF in 106 tuberculous meningitis which were treated fi rst from March 2012 to November 2014, as well collected 45 CSF in non- tuberculous meningitis patients as contrast group , then carried on comparative analysis. Results The sensibility of TB-DNA、Mycobacterial culture、T-SPOT.TB and TB-DNA + Mycobacterium rapidly develop were 23.1%，21.8%，80.9% and 45.5% in tuberculous meningitis group , The specif i city were 100%，100%，88.9% and 100% in non- tuberculous meningitis group. Conclusion The sensibility of T-SPOT.TB was the highest,TB-DNA + Mycobacterium rapidly develop can increase the detection rate, and provide effective and assistant method for early diagnosis and treatment of tuberculous meningitis.

TB-DNA ; Mycobacterium rapidly develop;T-SPOT.TB; Cerebrospinalf l uid

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.14.031

辽宁 121017 辽宁省锦州市传染病医院检验科（牟向欣）

牟向欣 E-mail：465451390@qq.com