白花三叶草对3种草坪草种子萌发、幼苗生长的化感作用

刘威　宣亚楠　袁晓婷等

摘要：研究不同浓度白花三叶草（Trifolium repense L.）水浸液对草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草3种禾本科草坪草种子萌发、幼苗生长以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等保护酶活性和丙二醛含量的影响。结果表明，白花三叶草水浸液对3种草坪草种子发芽率、发芽势、幼苗苗高均表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用趋势；对幼苗根长均有不同程度的抑制作用，水浸液浓度越高，抑制作用基本上也越强；对种子发芽指数、幼苗鲜质量的影响则因草坪草种类的不同而不同。在不同浓度的白花三叶草水浸液处理下，3种草坪草幼苗SOD、CAT活性呈现“低浓度上升、高浓度下降”的趋势，POD、APX活性和丙二醛含量则不同程度地升高。

关键词：白花三叶草；草坪草；化感作用；种子萌发；幼苗生长

中图分类号： Q945.79 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0171-04

白花三叶草（Trifolium repense L.）为豆科车轴草属多年生草本植物，喜阳耐阴，具有适应性广、抗热抗寒性强、生长迅速、绿期长等优点，在世界各地作为优良草坪草广泛栽植。近年来，我国北方寒冷地区为了改善城市中草坪的适应性并延长其绿期，人们常将白花三叶草与冷季型禾本科草坪草混合建植草坪[1-2]。研究表明，白花三叶草会侵占禾本科草坪，在禾本科草坪上形成小群落，影响原有的景观效果[1]。白花三叶草入侵禾本科草坪过程中，化感作用（allelopathy）被认为是一个重要因素[3-6]。植物的化感作用是植物通过茎叶挥发、雨水淋溶、根系分泌、残体分解等途径向环境中释放化感物质（allelochemicals），从而对其他植物或自身的生长发育产生促进或抑制作用[6-7]。化感作用广泛存在于自然界中，是生态系统中自然的化学调控现象以及植物适应环境的一种机制。开展化感作用研究对于生态系统中植被形成及演替、植物生长发育调控具有重要意义[8]。研究表明，植物通过化感作用造成细胞伤害进而影响自身或其他植物生长发育过程中，植物细胞内活性氧自由基代谢失衡进而引起自由基积累以及膜脂过氧化，导致膜系统结构、功能受到损伤是重要原因之一[9-11]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等酶类是植物细胞在长期进化过程中形成的防御活性氧自由基毒害的保护酶系统，以维持植物体内活性氧自由基代谢的动态平衡[11-12]。目前，关于白花三叶草对冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株水浸液、挥发物、根系分泌物、腐解液等对受体植物种子萌发、幼苗生长的影响。研究表明，雨水淋溶是植物活体、残体释放化感物质的主要途径之一[13]。本研究以我国北方寒冷地区草坪建植中经常使用的3种冷季型禾本科草坪草即草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草为材料，用蒸馏水浸提白花三叶草植株模拟自然雨水淋溶过程，研究不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子萌发、幼苗生长、SOD等保护酶活性以及丙二醛（MDA）含量的影响，旨在为进一步研究白花三叶草侵占禾本科草坪的原因提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜的生长良好的白花三叶草全株采自东北农业大学校园内。受体植物草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.）种子均购自江苏圣园种子培育基地。

1.2 方法

1.2.1 白花三叶草水浸液的制备

将白花三叶草全株去除杂质，用蒸馏水洗净后用吸水纸吸干水分。取白花三叶草全株25 g，用剪刀剪成长1～2 cm的小段，倒入三角瓶中，加入 250 mL 蒸馏水浸泡48 h（每隔12 h用玻璃棒搅动1次），用布氏漏斗过滤，得到0.100 g/mL白花三叶草水浸液。用蒸馏水稀释该水浸液，分别获得0.005、0.025 g/mL水浸液，4 ℃保存备用。

1.2.2 草坪草种子萌发试验

采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验。首先用0.1%HgCl2溶液对3种草坪草种子消毒10 min，用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3次。分别选择大小均一、籽粒饱满的3种草坪草受体种子各100粒，用消毒过的镊子将其均匀放置于铺有2层滤纸的培养皿中，分别加入不同浓度（0.005、0.025、0.100 g/mL）的白花三叶草水浸液10 mL，以蒸馏水为对照（CK），每处理重复3次。试验期内适量补充蒸馏水以保持培养皿内滤纸湿润。将加有受体种子的培养皿放入人工气候箱中，于25 ℃进行培养，每隔 24 h 观察并记录萌发种子数（胚根或胚轴突破种皮1～2 mm为萌发）。3 d后计算发芽势（GE），7 d后计算发芽率（GR）、发芽势、发芽指数（GI）[6]。7 d后从每个培养皿随机挑选10株草坪草幼苗，用吸水纸吸干水分，用电子天平称量鲜质量，用直尺测量苗高、根长。各指标计算公式如下：

式中：IR为抑制率，%；C为对照值，T为处理值；当IR>0时，表示抑制作用；当IR<0时，表示促进作用。IR绝对值大小代表化感作用强弱[6]。

1.2.3 保护酶活性、丙二醛含量的测定

7 d后从每个培养皿随机挑选若干株草坪草幼苗，用蒸馏水洗净，用滤纸吸干水分，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱内保存待用。采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）法[14]测定SOD活性，以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位。采用过氧化氢还原法[14]测定CAT活性，以1 min 240 nm处吸光度减少0.01定义为1个活性单位。采用愈创木酚法[14]测定POD活性，将1min 470 nm处吸光度增加0.01定义为1个活力单位。参照陈建勋等的方法[15]测定APX活性，以1 min 290 nm处吸光度降低0.01定义为1个酶活性单位。采用硫代巴比妥酸法[14]测定丙二醛含量，每个指标均重复测定3次。

1.3 数据处理

采用Excel 2007、SPSS 12.0软件处理数据，用Duncans方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 白花三叶草水浸液对草坪草种子萌发的影响

从表1可以看出，不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子的发芽率均表现为“低促高抑”的双重作用。与对照相比，0.005 g/mL白花三叶草水浸液处理下，草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草种子的发芽率均提高，但差异均不显著；随着白花三叶草水浸液浓度的增加，对3种草坪草种子的发芽率抑制率提高，0.100 g/mL白花三叶草水浸液处理的抑制作用最强。

不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子的发芽势亦表现为“低促高抑”的双重作用。0.005 g/mL白花三叶草水浸液处理的促进作用最强，0.005 g/mL白花三叶草水浸液处理下，高羊茅、多年生黑麦草发芽势与对照相比差异显著（P<0.05）。当白花三叶草水浸液浓度≥0.025 g/mL时，对3种草坪草的发芽势整体呈抑制作用，且水浸液浓度越高，抑制作用越强。不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子的发芽指数影响不同，但在高浓度下均呈抑制作用，明显延缓了草坪草种子的发芽进程。不同浓度白花三叶草水浸液对草地早熟禾、高羊茅的发芽指数均表现为“低促高抑”的双重作用，0005 g/mL白花三叶草水浸液处理提高了2种草坪草的发芽指数，但只有高羊茅处理与对照相比差异显著（P<005）。与对照相比，0.100 g/mL白花三叶草水浸液处理显著降低了草地早熟禾、高羊茅的发芽指数。不同浓度白花三叶草水浸液均对多年生黑麦草的发芽指数产生抑制作用，随着水浸液浓度的增加，抑制作用增强。

2.2 白花三叶草水浸液对草坪草幼苗生长的影响

从表2可以看出，不同浓度白花三叶草水浸液对草坪草幼苗苗高整体表现为“低促高抑”的双重作用（除多年生黑麦草）。0.005 g/mL 白花三叶草水浸液处理对3种草坪草幼苗苗高的促进作用不明显，与对照相比均无显著差异。随着白花三叶草水浸液浓度的增加， 对3种草坪草苗高的抑制作用愈加明显。

不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗根长均有不同程度的抑制作用，基本表现为白花三叶草水浸液浓度越高，抑制作用越强。0.100 g/mL白花三叶草水浸液处理对草地早熟禾、高羊茅根长的抑制作用最强，与对照相比差异显著（P<0.05）。0.025 g/mL白花三叶草水浸液处理对多年生黑麦草根长的抑制作用最强。不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗鲜质量的影响因草坪草种类的不同而不同。白花三叶草水浸液对草地早熟禾的鲜质量表现为强烈的促进作用。不同浓度白花三叶草水浸液对高羊茅、多年生黑麦草鲜质量整体表现为“低促高抑”的作用趋势。

2.3 不同浓度白花三叶草水浸液对草坪草幼苗保护酶活性、丙二醛含量的影响

由表3可知，不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保护酶的活性及丙二醛含量均产生明显的影响，但影响趋势不同。

不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗SOD、CAT活性均表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用趋势。当白花三叶草水浸液浓度为0.005 g/mL时，3种草坪草幼苗SOD、CAT活性均高于对照，但差异不显著。当白花三叶草水浸液浓度≥0.025 g/mL时，3种草坪草幼苗SOD、CAT活性均受到明显抑制，且抑制作用随着水浸液浓度的增加而增强。不同浓度白花三叶草水浸液均不同程度提高了3种草坪草幼苗POD、APX活性以及丙二醛含量。各处理下3种草坪草幼苗APX活性与对照相比均显著提高（P<0.05）。低浓度白花三叶草水浸液（0.025 g/mL）处理提高3种草坪草幼苗丙二醛含量的作用不明显。当白花三叶草水浸液浓度 ≥0.025 g/mL 时，除多年生黑麦草0.025 g/mL处理外，其他处理下3种草坪草幼苗丙二醛含量与对照相比均显著提高（P<0.05）。

3 结论与讨论

白花三叶草原产于欧洲、北非，作为优质牧草在全世界范围内广泛栽植。近年来，在我国北方寒冷地区，白花三叶草常与冷季型禾本科草坪草混合栽培应用。白花三叶草植株低矮，根系发达，主茎短，茎节上长出匍匐茎，茎节向下产生不定根，根部具有较强的分蘖能力、再生能力，成坪迅速，具有很强的侵占性。研究表明，同其他草坪草竞争光照、水肥等是白花三叶草侵占禾本科草坪的原因之一[16]。白花三叶草能够通过释放化感物质来抑制禾本科草生长，从而形成单一群落或者侵入禾本科草草坪[2-6]。本研究以白花三叶草为材料，用蒸馏水浸提白花三叶草植株模拟自然雨水淋溶过程，采用生物测定法研究不同浓度白花三叶草水浸液对草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麦草3种常见冷季型草坪草种子萌发、幼苗生长的影响，并对不同处理下3种草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保护酶活性以及丙二醛含量进行了测定。结果表明，白花三叶草水浸液对3种草坪草的种子萌发、幼苗生长均产生不同程度的影响，SOD等保护酶的活性以及丙二醛含量均发生不同程度的变化，由此可知白花三叶草对草坪草具有化感作用，可以通过雨水淋溶释放化感物质影响草坪草的生长。不同浓度的白花三叶草水浸液对3种草坪草的种子发芽率、发芽势、幼苗苗高均表现出低浓度促进、高浓度抑制的双重作用。不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草种子发芽指数影响不同，但在高浓度下（≥0.025 g/mL）均表现为抑制作用，明显延缓了草坪草种子的发芽进程。不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗根长均有不同程度的抑制作用，水浸液浓度越高，抑制作用越强。不同浓度白花三叶草水浸液对3种草坪草幼苗鲜质量的影响因草坪草种类不同而不同，这可能与种子体内物质的种类、浓度及转化途径不同有关[6]。研究表明，化感物质对受体植物生长发育的化感作用机制是通过影响其细胞生长分化实现的[17-18]。Cruz等认为，化感物质破坏细胞膜的功能也是对受体植物产生化感抑制作用的机制之一[19]。SOD等植物保护酶系统具有清除活性氧自由基、减轻膜脂过氧化程度等作用。本研究表明，与对照相比，低浓度白花三叶草水浸液处理（0.005 g/mL）增加了3种草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX活性，说明3种草坪草幼苗自身能够通过某些调节机制，提高SOD、CAT、POD、APX活性以减轻膜脂过氧化程度。随着白花三叶草水浸液浓度的增加，植物受伤害程度加大，SOD、CAT活性逐渐下降，POD、APX活性仍然维持在较高水平。这与刘迎等研究白花三叶草对苘麻、稗草的化感作用[10]以及张来等研究白花三叶草提取液对白菜等3种植物种子萌发、幼苗生长的影响结果一致[13]。MDA 作为膜脂过氧化的最终产物，其累积量会随着细胞伤害程度的加剧而不断增大[20]。在不同浓度的白花三叶草水浸液处理下，3种草坪草幼苗中丙二醛含量均高于对照，说明发生了膜脂过氧化反应，致使细胞膜系统遭到了破坏。研究证实，植物体内化感物质的种类、浓度、相互作用显著影响其对受体植物的化感作用，酚类物质是重要的水溶性化感物质之一[21-22]。白花三叶草水浸液中含有多种酚类物质，酚类物质在不同浓度的白花三叶草水浸液中含量不同，会产生不同的协同或拮抗作用[18]。此外，草地早熟禾等3种草坪草具有不同的生物特性，因此在感受不同浓度的白花三叶草水浸液的化感作用时，并未表现出整齐一致的作用规律[6]。

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