超声波辅助法对扇骨中蛋白质提取率的影响

刘达玉，肖龙泉，李杉杉，王加贝，王娟，邹强，张崟（.成都大学生物产业学院，四川成都6006；.四川理工学院生物工程学院，四川自贡64000；.西华大学生物工程学院，四川成都6009）

超声波辅助法对扇骨中蛋白质提取率的影响

刘达玉1，肖龙泉2，*，李杉杉3，王加贝1，王娟2，邹强1，张崟1
（1.成都大学生物产业学院，四川成都610106；2.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；3.西华大学生物工程学院，四川成都610039）

摘要：以猪扇骨等杂骨为原料，利用超声波辅助提取骨中的蛋白质。在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计，以蛋白提取率和提取液色泽为指标，确定超声波辅助提取骨蛋白的最佳工艺条件。试验结果表明，骨蛋白的最佳工艺条件为液料比1∶4（g/mL），提取温度120℃，提取时间60min，超声波功率200W，超声时间2min。在此试验条件下蛋白提取率为62.36%。

关键词：鲜骨；超声波辅助提取；蛋白质

我国每年肉类总产量近6 000万t，约占世界肉食总产量的1/4，居世界第一。在肉类生产中，每年产生近2 000万t的各类畜禽骨[1]。尽管骨中的营养成分丰富[2]，但由于目前我国加工技术落后，骨中的营养物并没有得到充分利用，不仅造成资源浪费，还给环境带来巨大的压力[3]。畜禽骨中含有丰富的钙和可溶性蛋白，全面吸收畜禽骨中的钙是最佳补钙途径之一[4]，蛋白水解物除包括部分人体必需的氨基酸外，几乎含有构成蛋白质分子的全部氨基酸[5-6]；骨蛋白质中90%为胶原蛋白，具有增强皮下细胞代谢活性、延缓衰老的功效[7-8]。因此，畜禽骨骼蛋白质兼备高吸收率和高生物学效价特点，是一种较为优质的蛋白质资源[9]。在鲜骨中，由于猪扇骨（肩胛骨）本身的独特生理结构，猪胴体分割后，猪扇骨等杂骨被单独分割下来，其需求量小，购买者少，因而未得到充分利用。猪筒子骨含有丰富的骨髓，大多被用于熬汤，已经得到较好利用，其价格是扇骨价格的2倍～3倍，因此，采用扇骨等杂骨制备美拉德反应前体具有明显的价格优势。

超声波辅助提取技术是一种新的提取分离技术，因具有提取时间短、效率高、提取液中杂质少、对有效成分结构破坏较小等优点[10]，故在食品工业得到广泛的应用。超声波技术是利用超声波的空化作用（破碎细胞）和机械作用（强化传质），使溶剂分子渗透到组织细胞中，使细胞中可溶性成分更好地与溶剂分子接触，从而更好更快地释放出来[11-12]。目前超声波技术在松仁蛋白[13]、啤酒废酵母蛋白[14]等提取方面已有报道，但鲜有骨蛋白提取的报道。蛋白质是美拉德反应的重要成分，提取液色泽反映了在提取过程中发生褐变程度，因此本文选择蛋白提取率和提取液色泽为考察指标。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

猪扇骨：市购。95%乙醇、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、氯化钠、硼酸、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、酒石酸铵、三乙醇胺、氢氧化钠等均为分析纯；甲基红（指示剂）、亚甲基蓝（指示剂）、钙羧酸（指示剂）。

1.2仪器与设备

JA3103N型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KDN-102C定氮仪：上海纤检仪器有限公司；CR-400色差计：柯尼卡美能达（中国）投资有限公司；11-2-B5电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；FW-400A倾斜式高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3骨蛋白的提取工艺

猪骨→预处理→粉碎→加水→超声处理→高温提取→过滤→静置油液分离→浓缩→成品

1.4猪骨的预处理

将市购的猪扇骨砸碎后清水清洗2次～3次后浸泡1 h，去除血水，沥干后将猪骨放置于-18℃冻库冷冻保存，经冷冻的猪骨易于粉碎，最大粉碎颗粒不超过3mm×3mm×3mm。

1.5蛋白质提取率及钙含量的测定

蛋白质含量：参考GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；Ca含量：配位滴定法（EDTA法）[15]。

式中：m0为猪骨的质量，kg；m1为猪骨汤的质量，kg；c0为猪骨中蛋白质的质量分数，%；c1为猪骨汤中蛋白质的质量分数，%。

1.6色泽测定

色泽测定用色差计测定样品的色差；L*值（Lightness，亮度），其值从0到100变化；0表示黑色，100表示白色（色差值感觉色差程度见表1）。

表1　NBS单位色差值感觉色差程度Table1　The degreeof different sensation of unit chrom atic aberration

1.7猪骨蛋白提取最佳工艺条件的确定

1.7.1料液比的确定

在提取温度为110℃，提取时间为90min，料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/m L）分别进行骨蛋白提取。

1.7.2提取温度的确定

根据确定的料液比，提取时间为90min，提取温度分别选择100、105、110、115、120、125、130℃考察温度对蛋白提取率的影响。

1.7.3提取时间的确定

根据确定的最佳料液比、提取温度、提取时间分别选择30、45、60、75、90、105、120 min考察时间对蛋白提取率的影响。

1.7.4超声功率的确定

根据确定的最佳料液比、提取温度、提取时间，超声功率分别选择100、200、300、400、500W考察超声功率对蛋白提取率的影响。

1.7.5超声时间的确定

根据确定的最佳料液比、提取温度、提取时间、超声功率，超声时间分别选择0.5、1、2、5、10、15min考察超声时间对蛋白提取率的影响。

1.7.6正交试验

选取料液比、提取温度、提取时间和超声波功率进行四因素三水平L9（34）正交试验设计，因素水平表见表2，以筛选最佳提取条件。

表2因素水平表Table 2　Factor in the levelof the table

2　结果与讨论

2.1不同料液比对猪骨蛋白提取率及色泽的影响

在提取温度为110℃，提取时间为90min，考察料液比对蛋白提取率的影响，结果如图1所示。

图1　料液比对蛋白提取率及色泽的影响Fig.1　Theeffect of solid-liquid ratio of protein extraction rateand the L*

料液比是猪骨质量与提取介质水的体积之比，它是影响猪骨蛋白提取率的一个重要因素。从图1可以看出，随着提取介质水的增加，猪骨蛋白的提取率和提取液L*值也随之增加，当料液比在1∶3（g/mL）时，蛋白提取率变化趋于平缓。料液比小，提取过程中液相浓度变化快，提取阻力增大，提取率降低；提取介质水的增加，提取过程浓度变化相对缓慢，传质推动力提高，提取率增加，当料液比在1∶2（g/mL）以上时，颜色变化存在较小色差。但水分过高会增加生产成本和后续处理难度，因此最佳料液比选择1∶3（g/mL）较好。

2.2不同温度对猪骨蛋白提取率及色泽的影响

在提取料液比为1∶3（g/mL），提取时间为90min，考察温度对蛋白提取率的影响，结果如图2所示。

图2　温度对蛋白提取率及色泽的影响Fig.2　Theeffectof tem peratureof protein extraction rateand the L*

从图2可以看出，温度对提取率影响很大。随着温度升高，蛋白提取率也相应增加。当温度从100℃升高到110、120℃上升到130℃时，蛋白提取率变化较为明显；在110℃到120℃变化相对平缓。110℃与120℃提取液冷却后凝固较好，似果冻；100℃与130℃提取液冷却后流动性较好。原因可能是100℃提取液蛋白提取率相对较小，冷却后不易凝固。由于蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键（偶极-偶极相互作用或氢键）或氨基酸的侧链（离子化，极性基团，非极性基团）同水分子之间发生了相互作用。130℃下，可能引起蛋白质分子解聚、亚基单位伸展、蛋白质内部的极性基团和疏水基团的暴露、蛋白质分子表面电荷分布的加强，都能使蛋白质的水合作用加强，从而提高流动性。考虑到120℃以上提取液颜色褐变较为严重，又不利于节能，选取提取温度为120℃较佳。

2.3不同时间对猪骨蛋白提取率和色泽的影响

在料液比为1∶3（g/mL），提取温度为120℃情况下考察提取时间对蛋白提取率的影响，结果见图3。

图3　提取时间对蛋白提取率及色泽的影响Fig.3　The effectof extract timeof protein extraction rateand the L*

从图3可以看出，随着提取时间的增加，蛋白提取率逐渐增加，60min后蛋白提取率增加速率相对变缓。亮度值（L*值）随着提取时间的增加而降低，提取时间在30 min～75min过程中提取液色泽变化轻微，75min～90min过程中色泽变化明显，提取90min后L*值趋于平衡。综合考虑，选取60min为提取时间较佳。

2.4超声波功率对猪骨蛋白提取率及色泽的影响

在料液比为1∶3（g/mL），提取温度为120℃，提取时间为60min，超声2 s、间歇1 s，超声时间20min，考察超声波功率对蛋白提取率的影响，结果见图4。

图4　超声功率对蛋白提取率及色泽的影响Fig.4　Theeffectof ultrasonic power ofprotein extraction rateand the L*

由图4可知，当超声波功率在100W～300W范围内，随着超声波的功率增大，蛋白提取率逐渐增高。这是由于功率增大，空化效应增强，蛋白质溶出增加，同时超声波的空化效应和机械效应会促进蛋白质向水相扩散。当超声波的功率大于300W时，蛋白提取率上升变得特别缓慢，可能是由于超声波空化作用达到一定的上限，空化作用力减弱，蛋白质分子黏滞性增强，阻碍蛋白溶出。

另外，随着超声功率增大，蛋白提取液颜色逐渐变乳白，脂肪出品率逐渐减少，功率为100W提取液较为澄清，气味较淡，脂肪腻味较重；200W提取液色泽变化和乳化效果明显；300W提取液颜色与200W提取液颜色相似，带有更浓的香味；400W提取液色泽较300W变化强烈，呈乳白色，带有轻微的脂肪氧化味。综合考虑，本试验最佳超声功率选择300W。

2.5超声时间对猪骨蛋白提取率及色泽的影响

在料液比为1∶3（g/m L），提取温度为120℃，提取时间为60min，超声2 s、间歇1 s，超声功率300W，考察超声时间对蛋白提取率的影响，结果见图5。

图5　超声时间对蛋白提取率及色泽的影响Fig.5　Theeffectof ultrasonic timeof protein extraction rateand the L*

由图5可知，当超声时间在0～2min范围内，随着超声时间变长，蛋白提取率逐渐增高。这是由于时间增加，空化效应增强，蛋白质溶出增加，同时超声波的空化效应和机械效应会促进蛋白质向水相扩散。当超声时间超过2min后，蛋白提取率开始下降，这是由于超声波空化作用达到一定的上限，空化作用力减弱，蛋白质分子黏滞性增强，阻碍蛋白溶出。

随着超声时间的增加，提取液色泽L*值逐渐增加，超声时间超过1min后，提取液色泽（亮度）有较明显的变化；超声时间超过5min后的提取液相对不超声提取液色泽存在强烈的色差，经超声的提取液色泽得到明显提升。超声波处理2min后，考虑到蛋白提取率下降和L*值上升，且超声波处理时间较短，再进行优化对实际生产贡献不大，因此不将超声处理时间纳入正交试验，本试验确定超声时间为2min。

2.6超声波对骨汤中钙含量的影响

在料液比为1∶3（g/mL），提取温度为120℃，提取时间为60min，超声2 s、间歇1 s，超声时间2min，考察超声波对骨汤中钙含量的影响，结果见图6。

由图6可知，随着超声波功率增加，骨汤中钙含量增加，当超声功率大于200W时，钙含量明显增高。这是由于超声功率增加，空化效应增强，同时超声波打碎了细小骨颗粒，增加了骨汤中的钙含量。

图6　超声波对骨汤中钙含量的影响Fig.6　Theeffectof ultrasonic power of calcium content in bone soup

2.7猪骨蛋白提取工艺的正交试验

通过单因素试验选取料液比为1∶2（g/mL）～1∶4（g/mL），提取温度为100℃～120℃，提取时间为30min～90min，超声波功率为200W～400W，进行正交试验，试验结果见表3。

表3　正交试验结果Table 3　Results oforthogonalexperim ent

表3　正交试验结果Table 3　Results oforthogonalexperim ent

蛋白提取率/% 1　1（1∶2）　1（100）　1（30）　1（200）　18.97 2 1　2（110）　2（60）　2（300）　31.48 3 1　3（120）　3（90）　3（400）　56.56 4　2（1∶3）　1　2　3　23.33 5 2　2　3　1　37.25 6 2　3　1　2　46.82 7　3（1∶4）　1　3　2　24.13 8 3　2　1　3　33.83 9 3　3　2　1　62.36 k1　35.67　22.14　33.21　39.53 k2　35.80　34.19　39.06　34.14 k3　40.11　55.25　39.31　37.91极差R　4.44　33.11　6.10　5.39因素主→次　BCDA优方案　B3C3D1A3编号　A料液比/ （g/mL）B提取温度/℃C提取时间/min D超声功率/W

由表3可知，对猪骨蛋白提取率影响因素大小依次为B（提取温度）＞C（提取时间）＞D（超声功率）＞A（料液比），最优方案为B3C3D1A3，即提取温度120℃，提取时间90min，超声功率200W，料液比1∶4（g/mL）。

正交分析所用正交表各列除因子以外，无空列，故将离差平方和最小项（A项）作为误差项，利用SPSS 13.0进行方差分析，分析结果见表4，提取温度（B）对猪骨蛋白提取率影响显著（Sig.＜0.05），而提取时间和超声功率对蛋白提取率影响较小。

表4 正交试验结果方差分析表Table 4　Varianceanalysisof orthogonal tests

2.8最优方案验证试验

根据正交试验得出的优方案条件进行蛋白质提取，以蛋白提取率为考察指标，验证其是否为最优方案，具体结果见表5。

表5 最优方案的验证试验Table 5　Resultof verification experim ents for optim al cooking conditions

表5结果表明：最优方案蛋白提取率仅高于9号试验0.02%，由于9号试验提取时间短于最优方案，从节能的角度考虑，选取9号试验作为最优方案，即提取温度120℃，提取时间60min，超声功率200W，料液比1∶4（g/mL）。

3　结论

试验结果表明：在料液比1∶4（g/mL）、提取温度120℃、提取时间60min、超声功率200W、超声时间2 min时蛋白质提取率最高。料液比、提取温度、提取时间与骨蛋白的提取率成正比；其中，温度对蛋白提取率影响最为明显，其次是提取时间、超声功率，在考察的4个因素中，料液比对蛋白提取率影响最小。经超声波预处理可提高骨蛋白提取率5%～6%，钙含量明显提高；当超声功率在200W以上，超声时间超过5min时，超声处理对提取液颜色影响明显。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.037

收稿日期：2014-09-16

作者简介：刘达玉（1964—），男（汉），教授，硕士，主要从事食品加工等研究工作。

*通信作者：肖龙泉（1988—），男，硕士研究生，从事食品发酵方向研究。

Effect of Ultrasound-assisted M ethod on Protein Extraction Rate of Pig Scapu la

LIUDa-yu1，XIAO Long-quan2，*，LIShan-shan3，WANG Jia-bei1，WANGJuan2，ZOUQiang1，ZHANGYin1
（1.College of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.Collegeof Biological Engineering，Sichuan University of Scienceand Engineering，Zigong643000，Sichuan，China；3.Collegeof Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

Abstract：Proteinswere extracted from pig scapula and collected bonesby ultrasonic-assisted extraction.On thebasisofsingle factorexperimentsand orthogonalexperiment，the optimum conditionswasdetermined based on the protein extraction rate and soup color.The optimum conditions of extraction were as follows：the material-to-water ratiowas 1∶4（g/mL），extraction temperature was 120℃，extraction timewas 60 min，ultrasonic powerwas 200W，ultrasonic timewas2min.Under these conditions，the extraction rate of protein was62.36%.

Keywords：bone；ultrasound-assisted extraction；protein