2，3，7－三羟基－9－（2，4－二羟基）苯基荧光酮荧光猝灭法测定微量铅

杜容山 王咏梅 黄应平 余 丽 贾丽婷

（1.宜昌市环境保护监测站，湖北 宜昌 443000；2.三峡大学 三峡库区生态环境教育部工程研究中心，湖北宜昌 443002）

工农业生产所排放的重金属广泛存在于水体和土壤之中，重金属元素的毒性不仅难以消减，而且有些重金属元素被微生物作用转化为毒性更强的化合物，如汞被转化为毒性更强的甲基汞.重金属离子在自然界中的广泛存在及污染特性带来很多负面影响，如生物体发生重金属离子中毒产生基因变异、诱发新有害物种的产生、引发环境灾害事故，大量的重金属离子通过食物链危害人体的身体健康，致畸、致突变、致癌.对重金属的含量进行科学准确检测是对重金属元素进行控制和治理的前期工作，因此，研究重金属元素的分析方法具有重要理论意义和现实意义.在重金属离子分析中，Pb2＋因生物毒性显著备受研究.目前常用的分析测定Pb2＋方法有分子光谱法［1］、原子吸收光谱法［2－4］、等离子体原子 发 射 光 谱法［5－6］等.分子光谱法以仪器相对廉价、操作简单、结果准确应用范围较广，分子光谱法中的荧光分析法以检出限低、灵敏度高受到重视.本文选用2，3，7－三羟基－9－（2，4－二羟基）苯基荧光酮（DHPF）作为荧光试剂，研究该试剂与Pb2＋配位反应产生荧光猝灭效应.实验结果表明：在pH 7.60NH3·H2O－NH4Cl缓冲溶液中，加入阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺（CTMAB），该试剂与Pb2＋发生配位反应产生荧光猝灭现象，荧光猝灭值与 Pb2＋的含量在0－1.60μg／5mL范围内呈线性关系.该方法用于狗牙根中Pb2＋的测定，结果满意.

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

F－4500型荧光分光光度计（日本日立公司），DELTA 320pH计（梅特勒－托利多仪器有限责任公司）.

分别配制1.00μg／mL的Pb2＋工作溶液，1.00×10－4mol／L的 DHPF乙醇工作溶液，1.00×10－3mol／L的CTMAB水溶液和NH3·H2O－NH4Cl缓冲溶液，pH 7.60.

1.2 实验方法

在10mL比色管中依次加入DHPF溶液、CTMAB水溶液、NH3·H2O－NH4Cl缓冲溶液和Pb2＋工作液，其体积分别为0.22mL、0.40mL、1.60mL和1.0mL，用二次蒸馏水定容至5mL，摇匀.用同样方法配制试剂空白.室温下放置12min后，在荧光光度计上EX和EM 都为2.5nm，于λex＝506nm，λem＝538nm处分别测定试剂空白荧光强度F0和三元体系荧光强度F，计算荧光猝灭值ΔF（ΔF＝F0－F）.

2 结果与讨论

2.1 荧光发射光谱图

pH 7.60NH3·H2O－NH4Cl缓冲介质中，用荧光光度计分别扫描不同体系的荧光强度如图1所示.DHPF的最大激发波长和最大发射波长分别为λex＝506nm，λem＝538nm（图a）；在图a的体系中加入Pb2＋，DHPF与Pb2＋发生配位反应，其体系荧光强度减弱（图b）.在图a的体系中加入CTMAB，相对图（a）DHPF的荧光值变小（图c）；在图c的体系中加入Pb2＋，体系荧光值进一步变小（图d），其Pb2＋加入量与体系荧光猝灭程度成比例关系，依此建立荧光猝灭法测定微量Pb2＋，本文采用λex＝506nm，λem＝538 nm进行测定.

图1 荧光发射光谱

2.2 酸度的影响

考虑了不同的酸度介质 Na2HPO4－KH2PO4、Na2B4O7－NaOH、NH3·H2O－NH4Cl对荧光猝灭程度的影响，结果表明在NH3·H2O－NH4Cl介质中三元体系的荧光猝灭效果最为明显且稳定.在三元体系中改变NH3·H2O－NH4Cl缓冲溶液的pH值，试验酸度对体系荧光猝灭程度的影响，试验表明，在pH 7.55～7.66范围内荧光猝灭值较大且稳定（如图2所示），本文选用pH 7.60；该pH 值 NH3·H2ONH4Cl缓冲溶液用量在1.50～1.70mL范围内体系荧光猝灭值最大且恒定（如图3所示），本文选用1.60 mL.

图2 酸度的影响

图3 缓冲液用量的影响

2.3 荧光试剂用量的影响

DHPF是一种荧光强度比较大的试剂，不仅与重金属离子配位反应会产生荧光猝灭，自身分子间碰撞也会产生荧光猝灭效应，因此需要选用适合的DHPF浓度用量.实验发现，1.00×10－4mol／L DHPF乙醇溶液用量在0.20～0.26mL范围内荧光猝灭值最大且恒定（如图4所示），本文选用量为0.22mL.

图4 显色剂用量的影响

2.4 表面活性剂的影响

试验不同表面活性剂对荧光猝灭程度的影响.结果表明：阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）对增大荧光猝灭值效果最佳，阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）和非离子表面活性剂Tween－80几乎没有增大荧光猝灭值效果.1.00×10－3mol／L CTMAB用量在0.35～0.45mL较大且稳定（如图5所示），本文选用0.40mL.

图5 表面活性剂的影响

2.5 反应时间及稳定性

试验了荧光猝灭值与时间的关系，结果发现，试剂与重金属离子配位反应很快完全（如图6所示），用水浴给反应体系加热，当温度超过35℃时，体系的荧光猝灭值下降明显（如图7所示），本文选用室温下定容后4min进行测定.

图6 反应时间的影响

图7 温度的影响

2.6 工作曲线

按实验方法操作，在体系中加入不同量的Pb2＋绘制工作曲线.实验结果表明，体系的荧光猝灭值ΔF与Pb2＋含量在0～1.60μg／5mL范围内成线性关系，工作曲线回归方程为ΔF＝294.841 7×C＋4.715 6（C：μg／5mL），相关系数r＝0.999 1，测定Pb2＋检出限为0.02μg／5mL，定量限是0.06μg／5mL.

图8 工作曲线

2.7 配位化合物的配位比

平衡移动法可适用于弱离解试剂所形成的配位化合物的摩尔比测定，且对试剂的纯度要求不是很高.在CTMAB过量存在下，采用平衡移动法测定配位化合物的组成比为Pb2＋∶DHPF＝1∶2（见图9）.

图9 配位比的确定

2.8 共存离子的影响

按实验方法操作，测定常见的离子对该体系的荧光猝灭值的影响程度.在测定条件下，对于1.00μg Pb2＋／5mL，荧光猝灭值△F相对误差不大于±5%时，视为不干扰，共存离子的允许量（以下离子含量均没有做到上限）为（μg）：Co2＋（4）；Ba2＋（60）；Cr6＋（6）；Ag＋（25）；Mg2＋（10）；Zn2＋（12）；Fe2＋（4）；Fe3＋（4，加入0.2mL 8.69×10－3mol／L酒石酸钠）；Mn2＋（6）；Cu2＋（5，加入0.2mL 6.56×10－2mol／L硫脲）；K＋（800）；Na＋（700）；F－（1 200）；NO3－（680）；SO42－（250）；Cl－（600）；酒石酸钠（400）；硫脲（1000）；抗坏血酸（8）；草酸钠（20）.

3 样品分析

取在两种Pb2＋浓度胁迫下生长的狗牙根各一株，先用自来水清洗5次，再用蒸馏水漂洗3次，晾干，分别装进自制的大信封中，放进干燥箱中60℃烘干并称重.将狗牙根用24mL HNO3－HCLO4（V∶V＝3∶1）90℃消煮，待溶液冒白烟把消煮温度提高到180℃，溶液近干时关掉电源，冷却，再加入10mL HNO3－HCLO4（V∶V＝3∶1）消煮，溶液近干时关掉电源、冷却，加二次蒸馏水赶酸调节溶液的酸度，加入抗坏血酸，静置，过滤，用二次蒸馏水洗涤，滤液和洗涤液一并收集，转入1 000mL容量瓶中，二次蒸馏水定容，用原子吸收法测定值作为参考值，用拟定方法测定狗牙根中Pb2＋的含量见表1.

表1 狗牙根中铅的测定

［1］ 邱 艳，叶群丽，刘 凯.二甲酚橙分光光度法测定土壤中铅的研究［J］.安徽农业科技，2011，39（21）：12742－12743.

［2］ Lenka Husakova，Jitka Sramkova，Tomas Cernohorsky.Direct Determination of Cd and Pb in Human Urine by GFAAS with Deuterium－lamp Background Correction U－sing Different Chemical Modifiers［J］.Chemia Analityczna，2007，52（4）：579－596.

［3］ 杜容山，王咏梅，宋笑飞.螯合树脂在线富集火焰原子吸收法测定痕量铅和镉［J］.分析科学学报，2012，28（4）：564－566.

［4］ Sitki Baytak.Solid－Phase Extractor with Ram Horn Powder for Lead and Cadmium Determination in Environmental Samples by Flame Atomic Absorption Spectrometry［J］.Acta Chimica Slovenica，2007，54（2）：385－391.

［5］ Sabarudin A，Lenghor N，Liping Y，et al.Automated Online Preconcentration System for the Determination of Trace Amounts of Lead Using Pb－selective Resin and Inductively Coupled Plasma－atomic Emission Spectrometry［J］.Spectroscopy Letters，2006，39（6）：669－682.

［6］ Mustafa Tuerkmen，Canan Ciminli.Determination of Metals in Fish and Mussel Species by Inductively Coupled plasma－atomic Emission Spectrometry［J］.Food Chemistry，2007，103（2）：670－675.