CCK- 8降低LPS诱导的小鼠单核细胞RAW264.7 CHOP/caspase- 11 /caspase- 1的表达

刘 威，段 林，许光明，于 峰，张晓静*，宋 宁*

(1.河北省胸科医院 骨科， 河北 石家庄 050041；2.河北医科大学 第二医院 呼吸内科， 河北 石家庄 050000；3.河北医科大学 基础医学院 法医学系， 河北 石家庄 050017)



CCK- 8降低LPS诱导的小鼠单核细胞RAW264.7 CHOP/caspase- 11 /caspase- 1的表达

刘 威1，段 林2，许光明3，于 峰3，张晓静3*，宋 宁2*

(1.河北省胸科医院 骨科， 河北 石家庄 050041；2.河北医科大学 第二医院 呼吸内科， 河北 石家庄 050000；3.河北医科大学 基础医学院 法医学系， 河北 石家庄 050017)

目的探讨CCK- 8对LPS激活RAW264.7细胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信号通路的影响。方法用LPS和(或) CCK- 8和(或) CCK- 8的1受体阻滞剂孵育RAW 264.7细胞，用Western blot法检测CHOP、caspase- 11蛋白表达，用试剂盒检测caspase- 1活性，用ELISA技术检测细胞培养上清中IL- 1β水平。结果与对照组相比，LPS组CHOP、caspase- 11表达水平均显著升高(P<0.05)，给予CCK- 8可有效抑制LPS诱导的CHOP、caspase- 11表达升高(P<0.05)，而预先给予CCK- 8的1受体阻滞剂可明显抑制CCK- 8的作用。caspase- 1活性变化、IL- 1β含量变化趋势均与CHOP、caspase- 11表达水平变化趋势一致(P<0.05)。结论CCK- 8通过受体1抑制CHOP/caspase- 11/caspase- 1表达，减少LPS诱导IL- 1β的生成, 发挥抗炎作用。

胆囊收缩素；脂多糖；C/EBP同源蛋白；caspase- 11；caspase- 1

内毒素的主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革兰阴性菌外膜的主要成分。LPS诱导巨噬细胞活化释放大量促炎性细胞因子在急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍综合征等危重病症的发病中发挥重要作用[1- 2]。八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK- 8)是广泛存在于体内多个系统的神经肽，具有多种生物学功能。本研究经过前期实验证实，CCK- 8作用于表达CCK受体的巨噬细胞通过激活多条信号通路，抑制LPS诱生多种促炎因子，提示CCK- 8的抗炎作用对于治疗炎性反应相关性疾病具有较好的应用前景[3- 6]。在 LPS诱导下巨噬细胞内质网应激标志蛋白转录因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表达增高，上调含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 11(cysteinyl aspartate specific proteinase 11，caspase- 11)表达，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase- 1)，促进IL- 1β生成，表明CHOP/caspase- 11/caspase- 1 信号通路在LPS启动巨噬细胞炎性反应过程中发挥重要作用[7- 8], CCK- 8对上述信号通路的调节作用尚不清楚，研究CCK- 8对LPS诱导巨噬细胞CHOP/caspase- 11/caspase- 1通路的影响对于阐明CCK- 8的抗炎机制以及药物开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：小鼠单核细胞RAW264.7(中科院上海细胞库)。以含体积分数为0.1胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养。2 d传代1次，取对数增殖期细胞进行实验。

1.1.2 实验药物：胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM高糖培养基(Gibco公司)，LPS(E.coli LPS，serotype 0111:B4)，CCK- 8(Sigma公司)，Caspase 1 Assay Kit和小鼠抗兔caspase- 11抗体(Abcam公司)，小鼠抗兔CHOP抗体(Bioworld公司)，CCK- 81受体阻滞剂 devazepide(Tocris公司)，IL-1β ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理: 小鼠单核细胞RAW264.7细胞传2～3代后随机分6组，分别为对照组(培养基中加入等体积0.9%氯化钠注射液)、LPS组(培养基中加入0.5 mg/μL LPS)、CCK- 8+LPS组(在加入LPS前10 min加入1×10-6mol/L CCK- 8)、CCK- 81受体阻滞剂+ CCK- 8+LPS组(在加入CCK- 8前10 min加入1×10-3mol/L CCK- 8的1受体阻滞剂devazepide)、CCK- 8的1受体阻滞剂组(培养基中加入1×10-3mol/L devazepide)、CCK- 8组(培养基中加入1×10-6mol/L CCK- 8)。1.2.2 Western blot检测CHOP、caspase- 11蛋白表达：收集细胞，加500 μL裂解液，20 μL蛋白酶抑制剂，5 μL PMSF在冰上裂解15 min后，4 ℃,14 000×g，离心15 min。蛋白定量后，采用聚丙烯酰胺凝聚电泳(SDS-PAGE)，通过电转移法将蛋白转移至PVDF滤膜上。用体积分数为0.05的脱脂奶粉封闭3 h，与1∶500的小鼠抗兔CHOP抗体(或小鼠抗兔caspase- 11抗体)4 ℃孵育过夜。再与1∶5 000 HRP标记的荧光标记羊抗兔IgG抗体室温孵育2 h。用荧光显色仪显色。采用β-tublin作为内参对照，分别以相应蛋白与β-tublin荧光强度比值表示该蛋白相对表达水平。

1.2.3 比色分析法测定caspase- 1活性：按照试剂盒说明书操作步骤收集细胞(2×106个细胞/mL)，加预冷50 μL裂解液，冰浴10 min，10 000×g，离心1 min，转移上清至新试管，进行蛋白浓度定量，调整蛋白浓度为4 g/L，加50 μL含DTT的反应液，5 μL 4 mmol/L YVAD-p-NA，37 ℃孵育1～2 h，用酶标仪测定样品在400 nm处的吸光度值(A400值)。将对照组吸光度值定为1，caspase- 1活性增高的倍数用其他组吸光度值与对照组吸光度值的比值表示。

1.2.4 ELISA方法测定IL-1β表达水平：药物处理后收集细胞培养上清液，4 ℃，1 500 r/min，离心10 min，分装，-80 ℃冻存。取上清，根据IL-1β检测试剂盒说明书所示方法用酶标仪测定样品在450 nm处的吸光度值(A450值)。根据标准品的结果绘制标准曲线，直线回归分析得出直线回归方程。将测得的不同检测样品的A值代入相应的直线回归方程中，即可得到IL-1β的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1CCK-8抑制LPS诱导的RAW264.7细胞CHOP蛋白的表达

与对照组相比，LPS组CHOP表达明显增高，预先给与CCK- 8可明显抑制LPS引起的CHOP表达的增高(P<0.05)。而在应用CCK- 8之前预先应用devazepide可明显抑制CCK- 8的作用(P<0.05)。CCK- 8组和devazepide组CHOP表达水平与对照组相比无明显差异(P<0.05) (图1)。

A.the CHOP expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of CHOP expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group图1 CCK- 8对LPS诱导RAW264.7细胞CHOP蛋白表达水平的影响Fig 1 Effect of CCK- 8 on the CHOP expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.2CCK-8抑制LPS诱导的RAW264.7细胞caspase-11蛋白的表达

与对照组相比，LPS组caspase- 11表达水平显著升高。与LPS组相比，CCK- 8 +LPS组caspase- 11的表达明显降低(P<0.05)，预先给与devazepide可明显抑制CCK- 8的作用(P<0.05) (图2)。

A.the caspase- 11 expression was detected by Western blot; B.densitometry analysis of caspase- 11 expression; data were representative of four independent experiments; #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with LPS group; ▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group图2 CCK- 8对LPS诱导RAW264.7细胞caspase- 11蛋白表达水平的影响Fig 2 Effect of CCK- 8 on the caspase- 11 expression induced by LPS in RAW264.7 cell

2.3CCK-8抑制LPS诱导的RAW264.7细胞caspase-1活性增加

LPS诱导caspase- 1活性增加，约为对照组的1.47倍；CCK+LPS组caspase- 1活性较LPS组有所下降，约为对照组caspase- 1活性的1.24倍。预先给与devazepide可明显抑制CCK- 8的作用，caspase- 1活性为对照组caspase- 1活性的1.38倍(图3)。

Data were representative of four independent experiments; #P<0.01 compared with control group; *P<0.01 compared with LPS group; ▲P<0.01 compared with CCK- 8+LPS group图3 CCK- 8对LPS诱导的RAW264.7细胞caspase- 1活性的影响Fig 3 Effect of CCK- 8 on the caspase- 1 activity induced by LPS in RAW264.7 cell

2.4CCK-8抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β生成增多

与对照组相比，LPS组IL-1β表达明显增高。与LPS组相比，CCK+LPS组IL-1β的表达明显降低(P<0.05)，预先应用devazepide可明显抑制CCK- 8的作用 (P<0.05) (表 1)。

表1 CCK- 8对LPS诱导RAW264.7细胞培养上清中IL-1β水平的影响

#P<0.05 compared with control group;*P<0.05 compared with LPS group;▲P<0.05 compared with CCK- 8+LPS group.

3 讨论

CHOP(C/EBP-homologous protein)，又称生长停滞及DNA损伤诱导基因153(growth arrest and DNA damage inducible gene 153, GADD153)，是内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)特异的转录因子之一。在生理状态下低表达，但在ERS时，被显著诱导表达，调节下游凋亡相关基因的转录，引起细胞凋亡[9]。LPS可以诱发巨噬细胞产生ERS，促进CHOP的表达，但并不引起巨噬细胞凋亡却启动了炎性相关的信号通路，促进IL-β的表达[7]，另有研究证实，与野生型小鼠相比，敲除CHOP基因的小鼠经LPS刺激后，肺泡灌洗液中IL-1β的含量明显降低，肺脏炎性病理改变明显减轻。表明CHOP的表达可能是LPS活化巨噬细胞炎症信号通路中的关键环节[10]。因此，控制巨噬细胞CHOP表达对抑制LPS诱生促炎因子具有重要意义。本研究发现，LPS作用细胞可引起CHOP蛋白表达显著增高，预先给予CCK- 8可明显抑制LPS诱导的CHOP蛋白表达增高，而CCK- 81受体抑制剂可有效逆转CCK- 8的作用，提示CCK- 8通过1受体抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的ERS, 降低CHOP表达。

敲除CHOP基因可抑制LPS作用诱导巨噬细胞caspase- 11表达，表明CHOP是LPS诱导巨噬细胞caspase- 11表达的关键因子[7]。本研究发现，CCK- 8可明显抑制LPS诱导的caspase- 11蛋白表达增高，这一作用可被CCK- 81受体抑制剂反转，caspase- 11的变化趋势与CHOP的变化趋势一致，提示CCK- 8通过1受体抑制CHOP的表达，降低caspase- 11的表达。caspase- 11可以通过蛋白水解作用激活caspase- 1[8]。本研究进一步检测caspase- 1活性，发现经LPS刺激，caspase- 1活性显著升高， CCK- 8可明显抑制LPS诱导的caspase- 1活性增加，这一效应可被1受体抑制剂所反转，结果与caspase- 11表达水平变化趋势一致，上述实验结果表明，CCK- 8通过1受体抑制LPS诱导的CHOP/caspase- 11/caspase- 1的表达。caspase- 1又称白介素- 1β 转化酶(interleukin- 1β-converting enzyme，ICE)[11]。CHOP/ caspase- 11/ caspase- 1 信号通路是LPS诱导IL-β生成的关键通路，为了验证上述实验结果，本研究又观察了细胞培养上清IL-β水平变化，结果证实CCK- 8可通过1受体降低IL-β的生成。

本研究证实，CCK- 8通过1受体抑制LPS诱导的CHOP/caspase- 11/ caspase- 1的表达，减少炎性因子IL-β的生成，对于阐明CCK- 8的抗炎机制，丰富CCK- 8及相关神经肽生物学作用的有关理论具有重要意义，同时也有利于CCK- 8相关抗炎药物的开发应用。

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CCK- 8 decreases the expressions of CHOP/caspase- 11/caspase- 1 induced by LPS in mouse monocyte RAW264.7 cells

LIU Wei1, DUAN Lin2, XU Guang-ming3, YU Feng3, ZHANG Xiao-jing3*, SONG Ning2*

(1.Hebei Chest Hospital, Shijiazhuang 050041; 2.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000; 3.Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

ObjectiveTo investigate the effect of CCK- 8 on CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cells.MethodsRAW264.7 cells were incubated with LPS and/or CCK- 8 and/or CCK- 8 1R blocking agent devazepide for indicated times. CHOP and caspase- 11 protein expressions were determined by Western blot, caspase- 1 activity was analyzed by kit, IL- 1β expression level was analyzed by ELISA.ResultsBoth CHOP and caspase- 11 expression were upregulated in LPS-activated RAW264.7 cell, which were inhibited by pre-treatment of CCK- 8. Pre-treatment of devazepide inhibited the effects of CCK- 8 significantly.The same effects were found in caspase- 1 activity and IL- 1β expression.ConclusionsCCK- 8 exerts an anti-inflammatory effect by inhibiting CHOP/caspase- 11/caspase- 1 expressions induced by LPS in RAW264.7 cell. CCK 1R may contribute to the anti-inflammatory effect of CCK- 8.

cholecystokinin；lipopolysaccharides；C/EBP homologous protein；caspase- 11；caspase- 1

2014- 05- 12

：2014- 10- 14

河北省自然科学基金(H2012206029)

*通信作者(correspondingauthor)：zhangxue781127@163.com；342840431@qq.com

1001-6325(2015)02-0178-05

研究论文

R 541.4

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