进展性脑梗死外周血炎症免疫因子m RNA表达的临床研究

孙志华,贺 婕,黄 淮

进展性脑梗死外周血炎症免疫因子m RNA表达的临床研究

孙志华,贺 婕,黄 淮

目的探讨急性进展性脑梗死与炎症免疫因子基因表达的关系。方法对38例进展性脑梗死、90例非进展性脑梗死患者进行白介素6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)mRNA表达测定。结果 进展性脑梗死组IL 6、IL-10m RNA表达水平明显异常于非进展性脑梗死组(P<0.05)。IL-6m RNA表达水平是脑梗死进展的危险因素。结论 外周血炎症免疫因子基因表达水平的异常与进展性脑卒中密切相关,可能参与进展性脑梗死的发病过程中。

进展性脑梗死;白介素6;白介素-10;肿瘤坏死因子-α;基因表达

脑梗死后炎症反应产生的炎症介质是缺血中心区和周围区神经元损伤的重要机制之一。本研究检测急性脑梗死患者血清炎症免疫因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平及其他临床生化指标,探讨其与脑梗死的早期进展之间是否相关,期待从新的角度为临床防治进展性脑梗死提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 入选标准 急性脑梗死患者,符合下列条件:发病48 h内入院;符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准,均经头CT和/或MRI证实;初发脑梗死,既往无神经系统疾病病史。病例排除标准:既往患有免疫系统疾病者、肿瘤者;发病前后存在感染者;发病前后使用激素、免疫抑制剂、非甾体类抗炎药物者;合并其他脏器严重并发症者(心、肝、肾功能不全者);确诊系因动脉炎发病的脑梗死患者。

根据上述入选及排除标准所得急性脑梗死组128例,男性81例,女性47例,年龄44岁～78岁(62.79岁±11.60岁),于入院当时、入院第3天以及第7天进行改良爱丁堡斯勘的那维亚神经功能缺损评分(SSS),采用进展性缺血性脑卒中评定标准:任何2次连续SSS评估时,在意识水平、上下肢运动、眼球运动中,任何1种有大于或等于2分的加重和/或在言语功能中有大于或等于3分的加重。除外脑梗死后出血、发生其他新梗死灶或因严重的感染、高热、心功能不全所致的病情进展,其中进展性脑梗死38例,非进展性脑梗死90例。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 全部患者入院次日清晨空腹即采静脉血10 ml,血生化指标:血糖(BG)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、纤维蛋白原(FIB)、血同型半胱氨酸(HCY)、高敏C反应蛋白(hs-CRP),抽血送至医院中心实验室检测。

1.2.2 血清炎症免疫因子αm RNA表达的测定

1.2.2.1 标本采集和总核糖核酸(RNA)提取 血液标本采集后3 h内进行总RNA的提取。加入适量的Trizol裂解细胞,再依次加入适量的氯仿、异丙醇、75%乙醇和DEPC水,分别纯化、沉淀、洗涤和溶解总RNA。微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度,吸光度D260 mm/D280 mm>1.80表明纯度高,可用于实验。

1.2.2.2 逆转录反应 反应总体积10μL,总RNA模板250 ng～300 ng,25 mmo l/L MgCl22μL,10逆转录反应缓冲液1μL,各10 mm ol/L的dNTPs混合物1 μL,RNA酶抑制剂0.25μL,5 U/μL AMV逆转录酶0.5 uL,O ligo dT Adap tor 0.5μL,以无RNA酶的灭菌水补充体积到10μL,混匀后稍离心。PCR仪上42℃反应30 min,99℃加热5 min,冰浴保存备用。

1.2.2.3 荧光定量PCR 由上海生物工程技术公司合成。反应总体积25μL。反应条件:95℃预变性4 min;94℃变性15 s,72℃延伸15 s,40个循环,每一次循环后72℃采集荧光强度数据。(6 5～9 4)℃,每0.5℃读取一次制备溶解曲线。表达水平以目的基因与内参β-actin的比值表示。

2 结 果

2.1 两组IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表达水平 进展性脑梗死组血清IL-6m RNA表达水平明显高于非进展性脑梗死组,IL-10m RNA表达水平明显低于非进展性脑梗死组(P<0.05);TNF-α水平略高于非进展性脑梗死组(P>0.05)。详见表1。

表1 两组IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表达水平(±s)

表1 两组IL-6、IL-10、TNF-αm RNA表达水平(±s)

组别n IL 6 IL 10 TNF α 09非进展性脑梗死组90 0.86±0.78 0.69±0.41 1.42±0.89 P <0.05<0.05>0.05进展性脑梗死组38 1.18±0.49 0.51±0.39 1.52±1.

2.2 Logistic回归分析 只有X1(IL-6 m RNA)、X4 (BG)、X11(hs-CRP)进入到最后的回归模型,这表明,X1、X4、X11对脑梗死的进展与否影响有统计学意义,X1、X4、X11的参数估计值的符号均为正,可认为它们是预示脑梗死发生进展的危险因素。从其比数比上看出,在因素X4、X11固定不变时,因素X1的水平每增加一个等级(1)所引起的脑梗死发生进展的近似相对危险度为增加前的3.154倍;在因素X1、X11固定不变时,因素X4每增加一个等级(1 mmol/L)所引起的脑梗死发生进展的近似相对危险度为增加前的2.484倍;在因素X1、X4固定不变时,因素X11每增加一个等级(1 mg/L)所引起的脑梗死发生进展的近似相对危险度为增加前的1.856倍。对脑梗死发生进展的相对贡献:X1>X4>X11。

3 讨 论

进展性脑梗死患者临床症状进行性加重的病理生理机制还不太清楚,尽管有一些临床的、放射学的和生化因素被认为与早期的神经功能恶化有关,但是预测价值大多较低。过度的炎症反应可加重患者神经细胞缺血缺氧,导致病情恶化和进展[1]。

本课题重点研究进展性脑梗死的细胞因子基因表达方面的改变。血清IL-6是一种在机体防御、急相反应、免疫反应和造血反应等过程中起重要作用的多效细胞因子。IL-6可以刺激急性期反应蛋白合成增多,黏附分子表达增加,直接损伤血管内皮细胞和神经细胞;并促进凝血状态和血管收缩;使兴奋性氨基酸、一氧化氮释放量增加,加重脑组织水肿、神经细胞坏死和凋亡[2]。本研究结果显示,进展性脑梗死在临床症状恶化前其血清IL-6m RNA表达水平明显高于非进展性脑梗死,提示IL-6参与局灶性脑缺血后的急性反应,与早期的临床症状加重有关。经回归分析也表明IL-6m RNA表达水平是脑梗死进展恶化的独立危险因素。

Kucharzik等[3]发现,IL-10可抑制单核细胞趋化蛋白的表达,后者在动脉硬化过程中早期参与介导单核细胞的聚集。体外实验也表明[4],IL-10缺陷小鼠比正常小鼠的神经皮质细胞对兴奋毒性和低糖低氧更易受到损伤。外部给予或内源产生的IL-10对脑缺血有神经保护作用。本研究结果表明,IL-10m RNA表达水平的降低与脑梗死发生有一定关系。预先应用TNF-α可提高脑缺血耐受性,达到与缺血预处理相同的神经保护效果[5,6]。TNF-αm RNA表达水平在进展性脑梗死组的研究中,未见明显增高趋势,回归分析亦不提示为进展性卒中的危险因素,说明TNF-α水平与缺血性卒中神经功能恶化的关系不明显,与国外文献报道一致。

高水平的IL-6 m RNA表达和低水平的IL-10m RNA表达在脑梗死的发病中具有重要作用。对炎症因子在脑梗死发病中作用的研究,特别是进展性脑梗死及其关系的研究,有助于揭示脑梗死发病以及其神经功能恶化的病理生理过程,并为临床防治进展性脑梗死发生和减轻其急性期应激反应、保护缺血神经元提供一定的理论依据。应用炎性因子的抗体对脑梗死患者进行治疗,有可能是今后治疗缺血性脑卒中的一条重要途径。

[1] Ahmad M,G raham SH.Inflammation after stroke:Mechanism and the rapeutic approaches[J].Transl Stroke Res,2010,1(2): 74-94.

[2] Tutto lom ondo A,Di Raim ondo D,Sciacca R,et al.Inflamm atory cytokines in acute ischem ic stroke[J].Curr Pharm Des,2008,14 (33):3574-3589.

[3] Kucha rzik T,Lugering N,Pauels HG,et al.IL-4,IL-10 and IL-13 down regula te monocyte-chemoattracting protein-1 production in activated in testina l cell[J].Clin Exp Imm unal,1998, 111:152.

[4] Spera PA,Ellison JA,Feue rstein GZ,et al.IL-10 reduces rat brain in jury follow ing foca l stroke[J].Neurosci Lett,1998,251: 189-192.

[5] Gad re E,Lassen NA.Apop lexy with rapidly dete riora ting sym ptoms stroke in prog ression:Hem odynam ic and clinical aspect [J].Ugeskr Laege r,1995,157:233-234.

[6] Linsbe rh PJ,Roine RO.Hyperglycem ia in acute stroke[J]. Stroke,2004,35(2):363-364.

Clinical Study of Inflammatory Immune Factors mRNA Expression in Patients with Progressive Cerebral Infarction

Sun Zhihua,He Jie,Huang Huai
Central Hospita l of China Petro leum and Natura l Gas Genera l Corporation,Langfang 065000,Hebei,China

ObjectiveTo investigate the relationship of progressive cerebral infarction(PCI)with seruminflammatory immune factors gene exp ression.MethodsThirty-eight patients with PCIand 90 patients with stabile cerebral infarction were enro lled.The leve ls of interleukin(IL)6,IL 10,tumor necrosis factorα(TNFα)gene expression were measured.ResultsThe levels of IL 6,IL 10 m RNA expression had more significant difference in patients with PCI than that in stabile cerebra l infarction.Gene expression of IL-10 was the risk factor in PCI.Conc lusionThe abnorma l levels of inflamm atory immune factorsm RNA expression may be c losely re lated to PCI.They may p lay an important role in progressive ischem ic stroke.

progressive cerebral infarction;interleukin-6;interleukin-10;tum or necrosis factor-α;gene exp ression

R743 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.009

1672-1349(2015)05-0583-02

2014-05-29)

(本文编辑 王雅洁)

中国石油天然气集团公司中心医院(河北廊坊065000),E-m ail:986932458@qq.com