GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比较

吴晶晶，仝佳，陈娟，袁靖，田洁，汤新逸，王胜军

（江苏大学医学院检验医学研究所，江苏镇江212013）

GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比较

吴晶晶，仝佳，陈娟，袁靖，田洁，汤新逸，王胜军

（江苏大学医学院检验医学研究所，江苏镇江212013）

目的：对3种单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）分型方法进行比较，选择准确有效的SNP分型方法对GITRL SNP-rs2236876A/G进行基因分型。方法：采用Taqman-MGB探针法，限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）法和直接测序法对GITRL SNP-rs2236876A/G进行分型并比较。结果：PCR-RLFP法分型结果直接通过电泳图可见，适合少量的实验对象；Taqman-MGB探针法通过不同的荧光区分不同的基因型，适合大量的实验对象；直接测序法交由测序公司测定，样本数量浮动范围较大，费用较高。结论：Taqman-MGB探针法适用于GITRL基因rs2236876A/G基因分型，PCR-RFLP法适用于基因分型结果的验证，直接测序法适用于鉴定有争议的PCR-RFLP法的验证结果。

Taqman-MGB探针；单核苷酸多态分型；PCR-RFLP；GITRL

快速经济地对糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体（GITRL）基因SNP-rs2236876进行分型，对于实验室研究SNP而言非常重要。目前，SNP分型的方法有多种，如探针法，限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）等，为了配合研究SNP的大量样本分析，我们需要一种经济、精确、有效的SNP分型方法。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料 常规PCR试剂（TaKaRa公司），PCRRFLP所用TaiⅠ限制性内切酶（TaKaRa公司），Taqman-MGB探针所用的组分（上海闪晶）。

1.1.2 仪器 定量PCR扩增仪CFX 96 Real Time system（Bio-Rad公司），凝胶成像及分析系统（北京赛智公司），电泳仪（Bio-Rad公司），低温台式高速离心机（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 确立用于比较实验方法的标准品 提取10例不同个体的外周血基因组DNA，提取方法参考文献［1］。对GITRL基因SNP-rs2236876A/G进行引物设计，设计的原则是将rs2236876A/G突变的位点包含在PCR产物内，并保证与引物上下端有一定的距离。PCR-RFLP所设计的引物序列见表1。用引物对所提取的10例基因组DNA进行常规PCR，产物交由上海英潍捷基公司测序，分析PCR结果，选择rs2236876A/G 3种不同基因型（AA，AG，GG）的样本作为标准品进行下一步分析。

表1 PCR-RFLP与Taqman-MGB探针的引物序列

1.2.2 基因分型方法

1.2.2.1 PCR-RFLP法［2］将选出的3例不同基因型的标准品进行常规PCR，针对rs2236876A/G选择能识别于该位点的限制性内切酶TaiⅠ，然后对PCR产物进行限制性内切酶反应，酶切结果行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，最后在紫外凝胶成像仪中观察酶切结果，根据酶切结果的不同进行基因分型。具体反应体系如下：10×PCR反应缓冲液2 μL、dNTP 1.6μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4 μL、DNA聚合酶0.2μL。

1.2.2.2 Taqman-MGB探针法［3］设计Taqman-MGB探针法所需的引物及探针，引物和探针序列见表1。在荧光定量PCR仪上选择两种荧光（FAM，VIC）进行基因分型。具体反应体系如下：双蒸水8 μL、TaqMan®SNP探针0.5μL、TaqMan®SNP引物0.5μL、TaqMan®Genotyping Master Mix 10μL、模板1.0μL。

1.2.2.3 直接测序法 将PCR产物直接送至上海英潍捷基公司进行直接测序，获得结果后，通过Chromas软件进行测序结果的分析。将分析结果在NCBI数据库中进行比对，确认基因型。

2 结果

2.1 PCR-RFLP法进行基因分型的结果

由图1可见3种不同的酶切结果，rs2236876GG样本被完全酶切，rs2236876AG样本部分被酶切，而rs2236876AA样本完全未被酶切，与预期结果相符。

图1 PCR-RFLP法对GITRL基因rs2236876进行基因分型的结果

2.2 Taqman-MGB探针法进行基因分型的分型图谱

根据FAM和VIC两种不同的荧光与不同基因型的结合分析，方块点所代表的基因型是rs2236876-GG，三角形点所代表的基因型是rs2236876-AG，圆形点所代表的基因型是rs2236876-AA，与预期结果相符合。见图2。

图2 Taqman-MGB探针法对GITRL基因rs2236876进行基因分型的荧光分型图

2.3 直接测序法进行基因分型的测序结果

从图3中序列的峰图谱可看出，在rs2236876A/ G位点处可见3种不同的峰图谱，rs2236876AG所对应的峰图谱中可见两种不同颜色的混合峰，而rs2236876GG和rs2236876AA分别对应的是不同颜色的单一峰，与预期结果相符合。

图3 直接测序法进行基因分型的测序结果分析图谱

2.4 3种基因分型方法的费用和耗时比较

预估计实验所要检测约400个样本的SNP，因此需要考虑费用和时间各方面因素，故需选择一种经济、快捷、准确性较高的基因分型方法。综合考虑，对3种不同的基因分型方法从费用和耗时的角度进行了比较，见表2。由表可知，PCR-RFLP法进行基因分型费用低，但耗时较长；TaqMan-MGB法费用较高，但耗时很短；直接测序法费用较高，耗时较长。

表2 不同基因分型方法的费用和时间比较

3 讨论

目前对基因多态性的研究越来越多，临床上多种疾病都与SNP有关。多数实验室都配有基因直接测序的仪器，而对无直接测序仪器的实验室而言，若要研究SNP，则需要找到一种高效、经济的基因分型方法。

作为第3代遗传标记的SNPs是基因组变异最常见的一种形式，大规模SNPs的鉴定和SNPs公共数据库的建立大大促进了复杂性疾病相关基因研究的发展［4］。研究证实，SNPs与消化道肿瘤有密切的关系［5］。此外，对于GITRL与肿瘤关系的研究亦是热点，考虑到GITRL与疾病有密切的关系［6］，本实验室拟从GITRL基因组学的角度分析其与疾病间的关系，从而为疾病的鉴定及治疗提供可能的依据［7］。

近几年来，GITR及其配体GITRL在抗肿瘤免疫中的作用引起了学者的广泛关注，尤其是通过调控GITR/GITRL系统作为一种治疗肿瘤的新途径的理念更是成为关注焦点。研究报道，GITRL基因SNP-rs2236876与过敏性哮喘有关［8］。本实验室针对GITRL基因rs2236876A/G进行基因分型方法的比较，根据实验室的情况，选择了Taqman-MGB探针法、PCR-RFLP法、直接测序法进行基因分型比较。我们发现采用PCR-RFLP法进行基因分型费用低，但耗时较长，且步骤较为烦琐；此外，虽然基因型能直接在琼脂糖凝胶电泳中鉴别出来，但易受客观因素（如PCR、电泳等）影响；Taqman-MGB法费用较高，但耗时很短，可在1 d之内检测出500例样本的SNP；直接测序法需要交由专业的公司测定，费用较高，耗时较长，得到结果后仍要做峰状图谱的分析，在本实验中不适用。

因此，我们选择了Taqman-MGB探针法作为GITRL基因rs2236876A/G基因分型的方法，将PCR-RFLP作为基因分型结果的验证方法，另外将直接测序法作为有争议的PCR-RFLP结果的确定方法。

［1］ 赵嘉慧，张华屏.外周血DNA提取方法的比较及改良［J］.山西医科大学学报，2006，37（1）：12-13.

［2］ Miao YZ，Xu H，Fei BJ，et al.PCR-RFLP analysis of the diversity of phytate-degrading bacteria in the Tibetan Plateau［J］.Can JMicrobiol，2013，59（4）：245-251.

［3］ Huang J，Gao C，Ding X，et al.MGB-based one-step multiplex real-time PCR method for rapid detection of HPV［J］.Cancer Biomark，2012，12（3）：107-113.

［4］ Baeten D，Van Damme N，Van den Bosch F，etal.Impaired Th1 cytokine production in spondyloarthropathy is restored by anti-TNFα［J］.Ann Rheum Dis，2001，60（8）：750-755.

［5］ Demontis D，Pertoldi C，Loeschcke V，et al.Efficiency of selection，asmeasured by single nucleotide polymorphism variation，is dependent on inbreeding rate in Drosophila melanogaster［J］.Mol Ecol，2009，18（22）：4551-4563.

［6］ Mosbruger TL，Duggal P，Goedert JJ，etal.Large-scale candidate gene analysis of spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］.J Infect Dis，2010，201（9）：1371-1380.

［7］ Chattopadhyay K，Ramagopal UA，Mukhopadhaya A，et al.Assembly and structural properties of glucocorticoidinduced TNF receptor ligand：implications for function［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（49）：19452-19457.

［8］ Bottema RW，Postma DS，Reijmerink NE，et al.Interaction of T-cell and antigen presenting cell co-stimulatory genes in childhood IgE［J］.Eur Respir J，2010，35（1）：54-63.

Com parison ofmethod for GITRL SNP-rs2236876 genotyping

WU Jing-jing，TONG Jia，CHEN Juan，YUAN Jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：Comparing three single nucleotide polymorphism（SNP）genotypingmethods，to choose an accurate and effective SNP genotypingmethod for rs2236876A/G of GITRL gene.M ethodsSNP genotyping for rs2236876A/G of GITRL were performed and compared by Taqman-MGB probe，the PCRRLFP and direct sequencing.Results：PCR-RLFP showed the genotyping result by electrophoresis，which was suitable for a small number of experimental subjects.Taqman-MGB probe showed the genotyping result by fluorescence，which was suitable for a large number of experimental subjects.Direct sequencingmethod was operated by the sequencing company which was expensive.Conclusion：For rs2236876A/G of GITRL gene，Taqman-MGB probemethod could be chosen for genotyping，PCR-RFLPmethod confirmed the genotyping results and，at the same time，the direct sequencing finally validated the result of PCR-RFLP.

Taqman-MGB probe；SNP genotyping；PCR-RFLP；GITRL

R393

A

1671-7783（2015）04-0308-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y130120

国家自然科学基金资助项目（81072453，31170849，30972748）；江苏省自然科学基金资助项目（BK2011472）；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX11_0608）；江苏省卫生厅医学科研基金资助项目（Z201313）；江苏省“青蓝工程”项目；江苏大学“拔尖人才工程”和高级人才基金项目

吴晶晶（1988—），女，硕士研究生；王胜军（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：sjwjs@mail.ujs.edu.cn

2013-06-04 ［编辑］ 刘星星