长链非编码RNA UCA1对胰腺癌PANC-1细胞系侵袭转移的影响

赵义，张尤历，张行行，王国英，龚爱华，刘鑫，徐岷

（1.江苏大学附属医院消化内科，江苏镇江212001；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

长链非编码RNA UCA1对胰腺癌PANC-1细胞系侵袭转移的影响

赵义1，张尤历1，张行行1，王国英1，龚爱华2，刘鑫1，徐岷1

（1.江苏大学附属医院消化内科，江苏镇江212001；2.江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：探讨尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）在胰腺癌细胞中的表达及其对胰腺癌PANC-1细胞系侵袭转移的影响。方法用荧光定量PCR法检测4种胰腺癌细胞系中UCA1的表达水平，选取PANC-1细胞系，将其随机分为对照组和实验组，对照组细胞转染空载Vector，实验组细胞转染UCA1表达质粒，比较两组细胞UCA1表达水平；Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验分别检测两组细胞迁移和侵袭能力；蛋白质印迹检测两组细胞MMP14、MMP2和MMP9蛋白表达。结果：UCA1差异性表达于4种胰腺癌细胞系中；与对照组相比，实验组细胞的迁移和侵袭能力明显增强（P＜0.01），细胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白表达水平均明显增加（P＜0.01）。结论：上调UCA1促进胰腺癌PANC-1细胞的体外侵袭转移。

胰腺癌；肿瘤转移；长链非编码RNA；尿路上皮癌抗原1

胰腺癌是致死性最强的实体肿瘤之一，约40%患者在确诊时已发生转移［1］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）虽无编码蛋白质的功能，却以RNA的形式参与调控染色体沉默、细胞分化、细胞凋亡和肿瘤发生发展等多种生物学过程［2］。研究发现，lncRNA在肿瘤转移中发挥重要的调控作用［3］，如H19［4］和MALAT-1［5］可促进胰腺癌的侵袭转移。

尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）是一种膀胱癌特异性lncRNA［6］。研究发现UCA1在食管癌［7］、肝癌［8］和结直肠癌［9］等消化道肿瘤中发挥致癌基因作用。Yang等［10］研究指出UCA1可能与胰腺癌有一定的关系。但是，UCA1在胰腺癌中的表达及其可能的作用尚不清楚。因此，本研究拟初步探讨UCA1在胰腺癌细胞系中的表达及其对PANC-1细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM高糖培养基、Opti-MEM、FBS（美国Gibco公司），MillicellRHanging Cell Culture Inserts（美国Millpore公司），BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber（美国BD公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒和荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司），基质金属蛋白酶（matrixmetallopeptidase，MMP）14、MMP2、MMP9和β-肌动蛋白单克隆抗体（美国Affinity公司），UCA1表达质粒和相应的空载Vector由美国密西西比大学Mo Yin-Yuan教授惠赠。

1.2 细胞培养

胰腺癌PaTu8988、BxPC-3、SW1990、和PANC-1细胞系由本实验室冻存。用含10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基于37℃含5%CO2的恒温培养箱培养人胰腺癌细胞系。

1.3 提取总RNA、反转录和荧光定量PCR

收集对数增殖期的细胞，用预冷PBS清洗3遍，按照Trizol说明书提取细胞总RNA，蛋白核酸分析仪检测其纯度及浓度，-80℃保存备用。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板扩增U6和UCA1。荧光定量PCR的反应体系为25μL，反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环。用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量（RQ值），计算公式为RQ=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的-Ct内参，ΔΔCt= ΔCt实验-ΔCt对照。

1.4 细胞转染

将细胞随机分为对照组和实验组，对照组细胞转染空载质粒，实验组细胞转染UCA1表达质粒。转染前1天将PANC-1细胞接种至6孔培养板，每孔5×105个细胞，保证细胞在24 h内汇合度达到80%～90%。按照LipofectamineTM2000说明书操作，将质粒和LipofectamineTM2000分别加入250μL Opti-MEM中，室温静置5 min，将二者混合，轻柔混匀，静置20 min后将500μL质粒/LipofectamineTM2000混合物逐滴滴入6孔培养板，于培养箱中孵育48～72 h后进行后续实验。

1.5 Transwell迁移实验和侵袭实验

1.5.1 Transwell侵袭实验 转染48 h后收集细胞，用无血清DMEM清洗细胞2遍，然后用无血清DMEM重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL，在小室下层加入含10%FBS的DMEM，上层则加入200 μL细胞悬液，培养箱中孵育24 h后取出小室，用干棉签轻轻擦去小室上层未穿过Matrigel胶的细胞，再用PBS润湿的棉签擦拭2遍，小室浸入4%低聚甲醛，室温固定30～60 min，然后将小室浸入0.1%结晶紫中染色30～60 min，用PBS清洗小室数次，室温风干。在200倍显微镜下随机计数5个视野的细胞数，所有实验重复3次。

1.5.2 Transwell迁移实验 步骤同侵袭实验，只是将Matrigel胶包被的小室换成不含胶的小室即可。

1.6 蛋白质印迹法检测细胞MMP的表达

转染48～72 h后收集细胞，用预冷PBS清洗3遍，加入适量RIPA/PMSF裂解液，冰上裂解30 min，4℃，14 000×g离心15 min，取上清液。蛋白样品经10%SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白于摇床上室温封闭2 h，一抗（β-肌动蛋白稀释比为1∶20 000，MMP14、MMP2和MMP9稀释比均为1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP标记的二抗（稀释比例为1∶5 000）于37℃温箱中孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光显影，凝胶成像系统分析处理。

1.7 统计学分析

用SPSS 16.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差±s）表示，两均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCA1 mRNA在4种胰腺癌细胞系中的表达

qRT-PCR结果显示UCA1差异性表达于4种胰腺癌细胞系中，其中PaTu8988中UCA1相对表达量最低，其次为PANC-1，而BxPC-3中UCA1的水平相对最高，综合考虑，本实验选取PANC-1细胞作为研究对象。见图1。

2.2 UCA1在不同质粒中的表达

转染质粒后，实验组细胞的UCA1相对表达量（800.86±21.67）明显高于对照组（1.00，t=-73.84， P＜0.01），表明转染UCA1质粒后，UCA1表达水平升高。

图1 UCA1 m RNA在4种胰腺癌细胞系中的表达

2.3 上调UCA1对PANC-1细胞迁移的影响

Transwell迁移实验结果显示，实验组细胞的迁移细胞数明显高于对照组（t=-22.67，P＜0.01），表明上调UCA1的表达促进PANC-1细胞的迁移。见图2。

图2 两组PANC-1细胞的迁移能力比较

2.4 上调UCA1对PANC-1细胞侵袭的影响

Transwell侵袭实验结果显示，实验组中穿过Matrigel胶的细胞数明显高于对照组（t=-17.43，P＜0.01），表明上调UCA1的表达促进PANC-1细胞的侵袭。见图3。

2.5 上调UCA1对MMP14、MMP2和MMP9蛋白的影响

如图4所示，实验组细胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白水平明显高于对照组（P均＜0.01），表明上调UCA1的表达促进MMP14、MMP2和MMP9蛋白的表达。

3 讨论

最初研究认为lncRNA是基因转录过程的“副产物”。近年来，研究指出lncRNA在表观遗传学、转录水平和转录后3个层面调控基因表达，参与多种疾病的发生发展，尤其是肿瘤［11］。其中一些lncRNA如UCA1、PCGEM1和ANRIL等可促进肿瘤的发生发展，而lincRNA-p21、GAS5和MEG3等作为抑癌基因在肿瘤生物学过程中发挥调控作用。UCA1差异性表达于绒毛组织、胎盘组织和各种胎儿器官，在成年组织中不表达，而在多种肿瘤中表达，提示UCA1可能是一种癌胚基因，在胚胎发育和肿瘤形成中发挥重要作用［12］。食管癌中高表达的UCA1可促进细胞增殖、迁移和侵袭［7］。Wang等［8］发现肝癌组织中UCA1表达明显高于癌旁组织，干扰UCA1的表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Han等［9］发现UCA1过表达促进结直肠癌细胞的生长并抑制其凋亡，提示UCA1在消化系肿瘤中表现为致癌基因。然而，UCA1在胰腺癌中的表达及其可能的作用还不清楚。

图3 两组PANC-1细胞的侵袭能力比较

图4 两组细胞MMP14、MMP2和MMP9的表达

本研究结果表明，UCA1差异性表达于4种胰腺癌细胞系，选取UCA1表达相对较低的PANC-1细胞作为研究对象，转染UCA1表达质粒用于上调PANC-1细胞的UCA1水平；Transwell侵袭实验和迁移实验结果显示，上调UCA1后，PANC-1细胞的迁移和侵袭能力明显增强。Yang等［13］发现沉默膀胱癌细胞的UCA1表达后，MMP14表达明显下降。MMP14可活化MMP2和MMP9［14］，而MMP2和MMP9在胰腺癌的转移中起重要作用［15］。本研究结果显示，上调UCA1后，PANC-1细胞的MMP14、MMP2和MMP9表达均增加。由此可见，UCA1可能通过影响MMP的表达在胰腺癌的侵袭转移中发挥重要作用。

综上所述，上调UCA1通过增加MMP14、MMP2和MMP9的表达促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。胰腺癌的转移机制比较复杂，本研究仅初步探讨UCA1在胰腺癌细胞转移中的作用，关于UCA1在胰腺癌转移中的调控作用尚需深入研究，如应用RNA pull down实验检测UCA1的靶蛋白。随着研究的不断深入，UCA1有望成为胰腺癌靶向治疗的新位点。

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Influence of long non-coding RNA UCA1 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell line PANC-1

ZHAO Yi1，ZHANG You-li1，ZHANG Xing-xing1，WANGGuo-ying1，GONG Ai-hua2，LIU Xin1，XU Min1
（1.Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the expression of urothelial carcinoma antigen 1（UCA1）in pancreatic cancer cell lines and its influence on the invasion and metastasis of the pancreatic cancer cell line PANC-1.M ethods：The expression level of UCA1 in 4 pancreatic cancer cell lines was detected by realtime PCR.PANC-1 cellswere randomly divided into Vector group and UCA1 group，which was transfected with Vector and UCA1-plasmid，respectively；the UCA1 expression level in two groupswas compared.The ability ofmigration and invasion in vitro in Vector group and UCA1 group weremeasured by Transwellmigration assay and Transwell invasion assay.The protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in two groups was analysed byWestern blotting.Results：UCA1 differentially expressed in 4 pancreatic cancer cell lines.Compared with the Vector group，the ability ofmigration and invasion in UCA1 group were dramatically enhanced（P＜0.01），and the protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in PANC-1 were increased（P＜0.01）.Conclusion：Up-regulation of UCA1 promotes the invasion and metastasis in vitro of PANC-1.

pancreatic cancer；tumormetastasis；long non-coding RNA；urothelial carcinoma antigen 1

R735.9

A

1671-7783（2015）04-0304-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150081

江苏省卫生厅科研资助项目（H201434）；镇江市科技支撑计划资助项目（SH2014024）

赵义（1988—），男，硕士研究生；徐岷（通讯作者），副主任医师，硕士生导师，E-mail：peterxu1974@163.com

2015-04-07 ［编辑］ 刘星星