ADAM17在胰腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖迁移的影响

吴衡

（江苏大学附属宜兴医院ICU，江苏宜兴214200）

ADAM17在胰腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖迁移的影响

吴衡

（江苏大学附属宜兴医院ICU，江苏宜兴214200）

目的：探讨解整合素金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM17）在人胰腺癌细胞株中的表达及其对细胞增殖迁移的影响。方法利用实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测3种人胰腺癌细胞株内ADAM17 mRNA和蛋白的表达水平。构建可诱导表达ADAM17-shRNA的慢病毒载体，转染人胰腺癌细胞株，并筛选出稳定转染的克隆细胞株。在不同浓度（0，30μg/mL）的多西环素诱导ADAM17-shRNA表达后，通过CCK-8法和细胞划痕实验检测人胰腺癌细胞的体外增殖、迁移能力。结果：ADAM17 mRNA及蛋白在人胰腺癌细胞株PANC1、SW1990和Patu8988中均有表达。与未诱导表达ADAM17-shRNA的对照组相比，诱导表达特异性ADAM17-shRNA后，细胞ADAM17蛋白表达和体外增殖、迁移能力均受到明显抑制（均P＜0.05）。结论：ADAM17在人胰腺癌细胞中高表达，在其增殖、迁移过程中可能发挥重要作用。

解整合素金属蛋白酶17；肿瘤坏死因子-α转化酶；胰腺癌；增殖；迁移

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，其发病率和死亡率近年来明显上升。由于其诊断和治疗都很困难，5年生存率＜1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。解整合素金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）是一种在体内广泛分布的Ⅰ型跨膜蛋白，是体内最主要的TNF-α裂解蛋白酶，能特异性水解跨膜型肿瘤坏死因子-α（TNF-α）前体，使其成为可溶性的TNF-α，体内90% TNF-α的裂解依靠其发挥作用［1-2］，因此最初称其为肿瘤坏死因子-α转化酶。ADAM17在多种恶性肿瘤组织中过度表达，可反映肿瘤的恶性程度，并在肿瘤的侵袭、转移过程中发挥重要作用，与肿瘤患者的预后关系密切。本文旨在探讨ADAM17在胰腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌PANC1、SW1990和Patu8988细胞株，人胚肾293T细胞，慢病毒骨架质粒Tet-pLKO-puro（Addgene公司）及包装质粒（PHR′-CMV-8.2△VPR、PHR′-CMV-VSVG）为本实验室保存；DMEM及胎牛血清（Gibco公司），LipofectamineTM2000试剂（Invitrogen公司），PCR试剂盒及胶回收试剂盒（TaKa-Ra公司），Stbl3超级感受态细胞，Eco R I、Age I、T4DNA连接酶（Fermentas公司），质粒大提及小提试剂盒（Omega公司），嘌呤霉素、多西环素及MTT（Sigma公司），蛋白酶抑制剂及PVDF膜（德国Roche公司），PMSF、BCA试剂盒（碧云天生物公司），鼠抗人β-肌动蛋白抗体（Bioworld公司），兔抗人ADAM17和pAKT抗体（Cell Signal公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胰腺癌SW1990，PANC1，Patu8988细胞株于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养至对数生长期，以2×105个/mL密度接种于6孔板内，继续培养48 h。

1.2.2 实时定量PCR检测ADAM17 mRNA表达水平 取上述3种细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，反转录后行PCR扩增。ADAM17引物序列上游：5′-TTATTGGTGGTAGCAGAT-3′；下游：5′-AAGTGTTCCGATAGATGT-3′，产物长度为440 bp。β-肌动蛋白上游：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′；下游：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，产物扩增长度为218 bp，引物均由上海生工生物技术公司合成。实时PCR反应条件：95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，40次循环。以β-肌动蛋白的表达作为内参照，计算基因的相对表达量。目的基因相对表达水平的计算公式：2-△△Ct=2-（△Ct目的基因-△Ct标准值），并以SW1990细胞株ADAM17 mRNA的相对表达作为100%。

1.2.3 蛋白质印迹法检测ADAM17蛋白的表达按蛋白浓度测定试剂盒（BCA）说明书操作，测定上述3种细胞蛋白浓度。取20μL样品进行SDSPAGE，200 mA转膜1.5 h，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，兔抗人ADAM17（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌动蛋白（1∶5 000）4℃过夜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后显色摄片。

1.2.4 慢病毒质粒构建 根据人ADAM17 mRNA序列，选择与pLKO.1质粒相兼容的ADAM17 shRNA寡核苷酸，sh-ADAM17正义链：5′-CCGGCCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGGTTTTTG-3′；反义链：5′-AATTCAAAAACCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGG-3′，含干扰靶序列的DNA寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成，用TE液稀释至1μg/μL，于95℃沸水中加热5 min，缓慢冷却至室温生成双链RNA。慢病毒骨架质粒Tet-pLKO-puro经Eco RⅠ及AgeⅠ双酶切，胶回收酶切的骨架质粒，与退火形成的双链干扰序列经T4DNA连接酶连接，并转入Stbl3超级感受态细胞中，挑取3个单克隆转化子，进行菌液PCR。上游序列：5′-GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3′；下游序列：5′-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3′，取阳性菌液再扩大培养进行质粒小提得到较纯的sh-ADAM17慢病毒质粒。

1.2.5 慢病毒包装、收获 包装病毒前1天取对数生长的人胚肾293T细胞接种于10 cm培养皿中，用不含双抗的10%FBSDMEM培养，第2天汇合度达60%～70%时，换无血清DMEM，按sh-ADAM17慢病毒质粒∶包装质粒PHR′-CMV-8.2△VPR∶包装质粒PHR′-CMV-VSVG=4μg∶3μg∶1μg的比例用LipofectamineTM2000试剂共同转染人胚肾293T细胞，6 h后换含10%FBS的DMEM继续培养。收集48和72 h的病毒上清液，4℃4 000 r/min离心10 min去除细胞碎片，分装于EP管中并于-80℃保存。

1.2.6 诱导稳定干扰细胞株的干扰序列表达并检测干扰效果 感染病毒的前1天取处于对数生长期的PANC1和Patu8988细胞分别种于6孔板内，使第2天细胞汇合度达60%～70%，感染病毒时换含聚凝胺的培养液，每孔加入500μL病毒液，使聚凝胺的最终浓度为8μg/mL。37℃、5%CO2中培养1 d，第2天重复感染1次，第3天用嘌呤霉素的最低筛选浓度进行筛选。pLKO-sh-ADAM17细胞种于6孔板内，细胞贴壁后，在DMEM中加入30μg/mL的多西环素处理，同时将未用多西环素诱导的细胞作为阴性对照组。继续培养48 h，然后提取蛋白，按BCA法检测蛋白浓度，取20μL样品进行SDSPAGE，200 mA转膜2 h，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别用兔抗人ADAM17和pAKT（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌动蛋白（1∶5 000）4℃过夜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后显色摄片，分析shRNA对ADAM17的干扰效果。

1.2.7 诱导ADAM17-shRNA干扰序列的表达并用CCK-8法检测细胞增殖的变化 取对数生长期的PANC1-pLKO-sh-ADAM17和Patu8988-pLKO-sh-ADAM17细胞，分别以4×104/mL密度接种于96孔板，将细胞分为两组，每组设5个复孔，其中将未用多西环素诱导的细胞作为阴性对照组，另一组采用30μg/mL多西环素诱导。细胞贴壁后，换含有相应浓度多西环素的DMEM继续培养至第3天，每孔换成含10%CCK8无血清培养基继续孵育0.5 h后终止培养。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的光密度值（D值）。肿瘤细胞增殖率（%）=D值诱导组/D值对照组×100%。

1.2.8 诱导PANC1-pLKO-sh-ADAM17细胞中干扰序列的表达并用细胞划痕实验观察细胞迁移的变化

先用标记笔在6孔板背后均匀划2道横线，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中分别接种约5 ×105个已诱导表达ADAM17-shRNA干扰序列的PANC1细胞（按照实验步骤“1.2.7”提及的方法处理细胞）。第2天用枪头垂直于背后的横线划痕。用PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。分别在划痕后0，12以及24 h摄影，观察划痕处的细胞生长状况并计算划痕区域面积，根据以下公式计算：划痕区域面积=细胞未覆盖划痕区域面积/原有划痕区域面积×100%。

1.9 统计学处理

数据以均数±标准差表示，应用SPSS 17.0统计软件分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组均数的比较采用LSD-t检验，P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM17在胰腺癌细胞株中的表达

实时定量PCR和蛋白质印迹法检测结果表明，ADAM17在PANC1、SW1990和Patu8988胰腺癌细胞株中均有表达，且在PANC1细胞株中表达量最高。见图1。

图1 3种未经处理的胰腺癌细胞株中ADAM 17蛋白及mRNA的表达

2.2 shRNA干扰ADAM17表达的鉴定及其对胰腺癌细胞生长的影响

成功构建稳转细胞株后，用多西环素诱导ADAM17-shRNA表达，蛋白质印迹法检测结果表明pLKO-sh-ADAM17能有效干扰胰腺癌PANC1和Patu8988细胞株ADAM17蛋白的表达。同时我们还发现ADAM17下游节点分子AKT磷酸化水平也相应地下调。见图2。细胞生长抑制实验显示，与未诱导表达ADAM17-shRNA的对照组比较，诱导组下调ADAM17的表达后，PANC1和Patu8988细胞株增殖率明显下降（P均＜0.05）。见图3。

图2 多西环素诱导后两种胰腺癌细胞株中ADAM 17蛋白的表达水平

图3 多西环素诱导后两种胰腺癌细胞株的相对增殖率

2.3 shRNA干扰ADAM17的表达对胰腺癌细胞PANC1迁移能力的影响

细胞划痕实验结果表明，划痕后12和24 h，下调多西环素组ADAM17的表达能明显增加划痕区域面积，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明下调ADAM17的表达能抑制PANC1细胞的迁移。见图4。

图4 多西环素对PANC1细胞迁移能力的影响

3 讨论

ADAM17属于解整合素-金属蛋白酶家族成员，与基质金属蛋白酶家族（MMPs）一样都属于含锌蛋白酶，能降解细胞外基质，具有蛋白剪切酶样的作用，能使一些与细胞膜结合的配体或细胞因子如TNF-α、双调蛋白、转化生长因子-α（TGF-α）和表皮生长因子（EGF）等脱落［3-5］，并能活化表皮生长因子受体（EGFR），从而调节细胞的多种生物学行为。由于这些配体已被证明在肿瘤的形成与进展中起重要作用，因此推测ADAM17分子参与了恶性肿瘤的发生及侵袭过程［6］。

既往研究发现ADAM17在胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等多种癌细胞中表达增高，其可通过EGFRPI3K-AKT信号通路促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移［7-9，10］。Kenny等［11］通过siRNA或者肿瘤坏死因子-α转化酶抑制剂下调ADAM17的表达，可阻碍双调蛋白、TGF-α的脱落和EGFR的活化，从而降低肿瘤的恶性程度。刘宏斌等［10］的研究显示，食管鳞癌组织中ADAM17 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常食管黏膜组织；ADAM17的表达与EGFR表达呈正相关，且两者的表达是食管鳞癌患者预后的独立影响因素。

既往有研究显示［12］，ADAM17在正常胰腺细胞中不表达或低表达，而在胰腺癌细胞中高表达。本实验首先检测了3种胰腺癌细胞株中ADAM17蛋白质和mRNA的表达，表明ADAM17与胰腺癌的发生、发展可能相关。其次我们通过构建sh-ADAM17慢病毒载体，转染PANC1和Patu8988细胞，并与未诱导表达ADAM17-shRNA的对照组比较。结果显示，shRNA能有效干扰ADAM17蛋白的表达，同时ADAM17下游节点分子AKT磷酸化水平也相应下调，说明ADAM17的表达可能通过AKT信号通路起作用。细胞生长抑制实验结果显示，与未诱导表达ADAM17-shRNA的对照组比较，下调诱导组PANC1和Patu8988细胞株ADAM17的表达能明显抑制胰腺癌细胞的增殖。为了进一步阐明ADAM17对胰腺癌细胞生长的影响，本研究通过细胞划痕实验，表明下调PANC1细胞株ADAM17的表达能明显抑制细胞的迁移。

有文献报道［13］，多西环素具有抑癌作用，但对胰腺癌是否具有抑制作用未见报道，且本实验使用多西环素作为诱导剂的浓度较低，因此可忽略其对胰腺癌细胞产生的影响。

综上所述，ADAM17能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移，ADAM17可能通过AKT信号通路在胰腺癌发生、发展中起重要作用，可作为胰腺癌治疗的一个新的靶点。

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Expression of ADAM 17 and its effect on proliferation and m igration in pancreatic cancer cell

WU Heng
（Department of Intensive Care Unit，the Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University，Yixing Jiangsu 214200，China）

Objective：To investigate the expression of a disintegrin and metalloproteinase-17（ADAM17）of human pancreatic cancer cell and it′s effect on proliferation and migration in human pancreatic cancer cell.M ethods：The protein and mRNA expression of ADAM17 in three human pancreatic cancer cellwere detected by using quantitative real-time PCR and Western blotting.The inducible lentiviral vectorsmediated short hairpin RNA（shRNA）interference targeting ADAM17 gene were constructed，and transfected it into pancreatic cancer cell line，then screened stably transfected clonal cell line.After different doxycline concentration to induce the expression of ADAM17-shRNA，cell proliferation and migration were analyzed by using the Cell Counting Kit-8（CCK-8）viability assay and scratch assay.Results：ADAM17 protein and mRNA were highly expressed in PANC1，SW1990 and Patu8988 human pancreatic cancer cells.After small interfering RNA（siRNA）to block the expression of ADAM17，the protein levels of ADAM17，cell proliferation and migration in the experiment group were significantly lower than that of control group（all P＜0.05）.Conclusion：ADAM17 protein and mRNA have been expressed highly in human pancreatic cancer cell and promotes the proliferation and migration of human pancreatic cancer cell.

a disintegrin andmetalloproteinase-17；TNF-αconverting enzyme；pancreatic cancer；proliferation；migration

R73-362

A

1671-7783（2015）04-0299-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140163

吴衡（1983—），男，江苏宜兴人，主治医师，硕士，主要从事肿瘤诊治研究。

2014-05-30 ［编辑］陈海林