人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的优化表达、制备及其对肿瘤生长的抑制作用

姜云水，李剑波，高孟，任皎，金素凤，陈刚，吴洁，庄昉成，田厚文



人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的优化表达、制备及其对肿瘤生长的抑制作用

姜云水1，李剑波1，高孟1，任皎2，金素凤1，陈刚1，吴洁1，庄昉成1，田厚文2

1 浙江省医学科学院病毒病研究所浙江省医学生物工程疫苗研究开发重点实验室，浙江杭州 310052 2 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206

姜云水, 李剑波, 高孟, 等. 人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的优化表达、制备及其对肿瘤生长的抑制作用. 生物工程学报, 2015, 31(4): 566–576.Jiang YS, Li JB, Gao M, et al. Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 566–576.

为提高人乳头瘤病毒(HPV) 16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子，对HPV16基因进行密码子优化，优化后的基因分别插入到pGEX-5X-1、pQE30和pET41a表达载体中，转化JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 表达菌，筛选出高表达菌株pET41a-HPV16s/BL21 (DE3)，目的蛋白从占全菌蛋白的10%以下提高到约28%，优化接种量、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间，获得最佳表达条件；通过15 L发酵罐发酵，SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg纯化及复性HPV16 L2E7融合蛋白，制备的融合蛋白纯度可达95%以上，经SDS-PAGE、Western blotting鉴定证实，制备的HPV16 L2E7蛋白加CpG佐剂对小鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用，有75% (6/8) 的小鼠不成瘤，为后续的疫苗产业化奠定基础。

人乳头瘤病毒16型，优化表达，发酵，纯化，宫颈癌，疫苗

根据世界卫生组织统计，宫颈癌是当前造成妇女癌症死亡的主要因素之一，严重威胁妇女健康[1-3]。分子流行病调查结果证实，生殖道的高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染与宫颈癌有着十分密切的关系，高危型HPV的慢性、持续性感染被认为是宫颈癌及其癌前病变的主要原因，HPV16、18型是最常见的型别，其中约55%的宫颈癌与HPV16型感染相关[2,4-5]。目前对宫颈癌的治疗主要采用放化疗和手术治疗，副作用大、复发率较高且花费较大。采用特异性的免疫方法即疫苗接种的办法预防和治疗HPV的感染是有效预防宫颈癌的重要手段之一。目前预防性疫苗研究已取得较大进展，在美国等发达国家已经上市使用，但其仅用于没有感染过HPV的人群[6-7]，针对已有的HPV持续性感染和宫颈癌及癌前病变患者，尚未有十分有效的免疫治疗方法用于临床，因此，研制高效、廉价的而且具备治疗作用的HPV疫苗迫在眉睫。

由于HPV在体外难于培养及其致癌性，完整的病毒颗粒不大可能发展为疫苗，只能研制基因工程疫苗。病毒的次要衣壳蛋白L2同时具有中和抗体表位和细胞毒性T淋巴细胞 (Cytotoxin T lymphocyte，CTL) 表位，肿瘤相关抗原E7是诱导和维持癌细胞恶性表型所必需的蛋白，L2与E7融合后免疫机体能产生体液免疫和细胞免疫[8-9]。本课题组选择HPV16型L2蛋白融合已去除转化活性的E7蛋白作为治疗性疫苗的靶抗原，通过密码子优化、表达载体及菌株的筛选，利用基因工程技术获得了1株高效表达HPV16 L2E7融合蛋白的工程菌株；然后通过优化表达菌的培养诱导条件，摸索高密度发酵工艺、层析纯化和复性工艺，制备了纯度≥95%的HPV16 L2E7融合蛋白，复性后的蛋白在初步的动物实验中显示了显著的肿瘤抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株

质粒pET41a、pGEX-5X-1、pQE30和大肠埃希杆菌JM109、JM109 (DE3)、BL21 (DE3)由浙江大学医学生物技术实验室馈赠。pET30a-质粒由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所应急技术中心提供，含HPV16 L2完整的编码区序列及经修饰的完整E7编码区 序列。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，Ex酶购自Invitrogen公司。DNA marker购自天为时代公司。羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标记物购自美国Sigma公司。HPV16型L2单抗和E7单抗均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所应急技术中心馈赠。胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司。SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg均购自GE Healthcare公司。

1.1.3 实验动物

C57BL/6(H-2b)小鼠，雌性，6−8周龄，购自中国医学科学院实验动物繁育中心。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的设计与合成

以pET30a-质粒中基因为模板，在保持编码的产物蛋白氨基酸序列不变的前提下，结合大肠杆菌优势密码子及mRNA的二级结构分析，利用基因密码子简并性原则，设计出适合在大肠杆菌中表达HPV16 L2E7融合蛋白的核苷酸序列，命名为HPV16。设计好的基因序列交予上海生工生物工程技术服务有限公司合成并插入pGEM-T Easy载体中，命名为pGEM-T-HPV16。

1.2.2重组表达载体的构建

根据载体序列分别设计3套引物，引物中加入RⅠ和Ⅰ酶切位点序列，采用PCR方法从pGEM-T-HPV16扩增出HPV16片段。PCR产物和载体pGEX-5X-1、pQE30、pET41a分别用核酸内切酶RⅠ和Ⅰ酶切。酶切后的载体和HPV16s基因片段用T4 DNA连接酶连接。连接后的产物分别转化感受态JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3)：pGEX-HPV16s、pQE30-HPV16转化JM109，pET41a-HPV16转化JM109 (DE3)和BL21 (DE3)。抗性筛选出来的克隆以PCR法验证，验证结果阳性的克隆进行基因测序验证。

1.2.3 高表达菌株的筛选

将上述筛选出的阳性克隆菌株pGEX-HPV16/JM109、pQE30-HPV16/ JM109、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)以及对照菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 根据载体的抗性分别接种于含抗生素Amp和Kana (100 μg/mL) 的LB培养基中，37 ℃、300 r/min振荡培养至600达0.6−1.0时，加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37 ℃诱导表达3 h。表达菌进行SDS-PAGE分析，根据表达量的高低筛选出目的菌株用于后续研究。

1.2.4 HPV16 L2E7融合蛋白的表达条件优化

筛选出的高表达菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 分别进行接种量和诱导条件的优化。表达条件的优化采用摇瓶试验方法，接种量分别选择0.5%、2%和4%，IPTG浓度分别选择终浓度为0.1、0.5和1.0 mmol/L，诱导温度选择30 ℃和37 ℃，诱导时间分别选择2、4、6和8 h，接种量比较采取每小时取样比浊法检测菌液600值；诱导条件比较采用离心收集菌体，进行8% SDS-PAGE，并用Quantity One软件分析蛋白表达量的百分比。高密度发酵条件以摇瓶摸索的结果为基础进一步优化。

1.2.5 HPV16 L2E7融合蛋白的发酵

高表达菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 经LB摇床培养至600达0.8−1.0时，以5%的接种比例接种至含TB培养基的15 L发酵罐中 (德国B.BRAUN，Biostat C plus) 中，发酵温度37 ℃，搅拌速度300−700 r/min，pH维持在7.0左右，溶氧保持在20%以上，期间恒定流加补料A (酵母粉100 g/L，柠檬酸5 g/L，氯化镁5 g/L，氯化钙2 g/L)，定时取样监测菌体密度，当600达25左右时，降温至30 ℃，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L进行诱导，期间根据发酵液中的葡萄糖浓度、pH值和溶氧反馈流加补料B (蛋白胨150 g/L，酵母粉100 g/L，葡萄糖250 g/L)，诱导4 h后下罐离心收获。离心后的菌体–20 ℃保存备用。

1.2.6 HPV16 L2E7融合蛋白的纯化及柱上复性

发酵收获的菌体经高压匀浆破碎后，离心收获包涵体沉淀，包涵体经洗涤后用变性缓冲液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，5 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.0) 溶解，离心收集上清。层析柱SP Sepharose Fast Flow用平衡缓冲液 (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，pH 8.0) 平衡，离心上清上柱吸附，用缓冲液B冲洗平衡后用缓冲液C (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L尿素，2 mmol/L DTT，1 mol/L NaCl，pH8.0) 梯度洗脱，收集目的蛋白峰。层析柱Q Sepharose Fast Flow用缓冲液D (20 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L 尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/LGSSG，pH 8.0) 平衡，目的蛋白峰收集液稀释后上柱吸附，用缓冲液D冲洗平衡至基线后，线性梯度缓慢增加缓冲液E (20 mmol/L Tris-Cl， 1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，pH 8.0) 浓度至100%，最后用缓冲液F (20 mmol/L Tris-Cl，1 mol/L尿素，10 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，1 mol/L NaCl，pH 8.0) 线性梯度洗脱，收集目的蛋白峰。复性后的目的蛋白在层析柱Superdex 200 pg上进一步纯化及替换缓冲液，复性后的蛋白最终替换至缓冲液G (20 mmol/L Tris-Cl，0.1 mol/L精氨酸，pH 7.5) 中保存。最终纯化产物进行SDS-PAGE、Western blotting、N端测序等鉴定。

1.2.7 HPV16 L2E7融合蛋白的肿瘤生长抑制实验

实验分为PBS对照组、HPV16 L2E7+CpG组 (CpG 10 μg/只，HPV16 L2E7分别为30 μg/只、60 μg/只、90 μg/只)，每组8只小鼠，将1.2×104个TC-1肿瘤细胞于C57BL／6小鼠腹股沟皮下注射，第二天经肌肉分别注射PBS和不同剂量的HPV16 L2E7蛋白+CpG佐剂，100 μL/只，两周后相同剂量蛋白加强免疫，每周观察肿瘤生长情况。

2 结果

2.1 密码子优化、表达载体的构建及高表达菌株的筛选

密码子优化后的大小为1 713 bp的全基因片段插入pGEM-T Easy质粒中，获得质粒pGEM-T-HPV16，HPV16密码子优化序列经测序与设计的理论序列完全相符。以质粒pGEM-T-HPV16为模板进行PCR扩增，引物端添加RⅠ和Ⅰ内切酶位点，获得 1 731 bp的PCR产物，经RⅠ和Ⅰ双酶切后插入表达载体pGEX-5X-1、pQE30、pET41a中，成功构建HPV16 L2E7的原核表达载体pGEX-HPV16、pQE30-HPV16、pET41a- HPV16，构建好的表达载体分别转化感受态JM109、JM109 (DE3) 和BL21 (DE3) 筛选得到表达菌pGEX-HPV16/JM109、pQE30- HPV16/JM109、pET41a-HPV16/JM109 (DE3)、pET41a-HPV16/BL21 (DE3)。表达菌经PCR法验证，扩增出与理论值相符的约 1.7 kb的产物片段 (图1)，表达载体经测序证明目的基因插入正确，序列未发生碱基突变。

IPTG诱导表达结果 (图2) 显示，与基因密码子优化前的对照菌株pET30a-HPV16/BL21 (DE3)相比，菌株pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表达量得到了明显提高，目的蛋白从占全菌蛋白的10%以下提高到约28%，因此确定pET41a-HPV16/BL21 (DE3) 作为最优菌株用于后续的蛋白制备研究。

图1 不同表达菌株的PCR鉴定

2.2 HPV16 L2E7融合蛋白的表达条件优化与发酵

前期研究表明本菌株繁殖30代 (10−15 h)内质粒保有率≥95%，因此整个发酵周期控制在10−15 h内。不同接种量600检测结果显示2%、4%和6%的接种量培养4 h内均已进入对数生长期，而0.5%的接种量进入对数生长期的时间明显推迟 (图3)；不同IPTG浓度不同时间诱导结果显示0.5和1.0 mmol/L的IPTG浓度诱导的目的蛋白表达量明显高于0.1 mmol/L，诱导2 h和4 h，目的蛋白表达百分比保持稳定，6 h后开始下降 (图4)；30 ℃和37 ℃诱导，目的蛋白的表达量未见明显差异 (图5)。高密度发酵条件以摇瓶摸索的结果为基础进行优化，接种量以5%和10%进行发酵实验，10%接种量获得的菌体总量比5%高，但是目的蛋白的相对表达量低于5%，而且发酵后期细菌增长过快造成补料添加速度跟不上，因此选择5%的接种量；诱导则采用 1.0 mmol/L IPTG浓度37 ℃诱导4 h。15 L发酵罐的发酵工艺为：摇瓶活化的菌种当600达0.8−1.0时，以5%的接种量接种，37 ℃培养约 5 h左右，600达到25以上，降温至30 ℃，加入IPTG进行诱导，诱导4 h后下罐收获发酵液约10 L，离心后收获菌体湿重约800 g。

2.3 HPV16 L2E7融合蛋白的纯化及复性

HPV16 L2E7在大肠杆菌内主要以不溶的包涵体形式存在，发酵产物经高压匀浆破碎离心后获得包涵体、包涵体经洗涤去除大量杂蛋白 (图6A)、8 mol/L尿素变性溶解后经SP Sepharose Fast Flow初步纯化，Q Sepharose Fast Flow柱上复性，Superdex 200 pg精细纯化后获得纯度≥95%目的蛋白的纯化产物 (图6B)。纯化产物Western blotting结果显示，在相对分子量约97 kDa处可见与L2和E7的抗体反应带 (图6C)。纯化产物SDS-PAGE割胶纯化后的蛋白质N端测序结果显示与理论序列相符。

图2 不同表达菌株表达量的SDS-PAGE分析

图3 接种量对重组表达菌株pET41a-HPV16sl2e7/ BL21 (DE3) 生长的影响

图5 诱导温度和诱导时间对HPV16 L2E7融合蛋白表达量的影响

2.4 HPV16 L2E7融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用

PBS对照组在接种肿瘤细胞后28 d内全部成瘤，抑瘤率 (0/8，0%)，HPV16 L2E7+CpG 30 μg组有2只小鼠不成瘤，抑瘤率 (2/8，25%)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg组有6只小鼠不成瘤，抑瘤率 (6/8，75%) (图7)。与PBS对照组相比，HPV16 L2E7+CpG 30 μg组的抑瘤率虽有不同，但差异无统计学意义 (=0.13)，HPV16 L2E7+CpG 60 μg和90 μg组则差异性极显著 (＜0.01)，而HPV16 L2E7+CpG 30 μg组和60 μg、90 μg组则差异显著 (0.05＞＞0.01)。

3 讨论

治疗性疫苗的作用机制主要是诱发强的CTL反应，从而识别并杀伤被病毒感染的细胞。HPV治疗性疫苗的靶抗原主要为衣壳蛋白和早期与肿瘤相关的蛋白。主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2中含有中和抗原表位和CTL表位，其与肿瘤相关抗原E6或E7融合后能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫[8]，E6、E7基因在癌前病变和宫颈癌中是持续表达的，它们通过失活PRb和P53抑癌蛋白，破坏细胞周期调控，从而导致上皮细胞的恶性转化[10-12]，L1或L2融合去除转化活性的E6和或E7蛋白可作为治疗性疫苗的靶抗原[13-15]。相对于型特异性的L1基因，L2全长或L2 N端高度保守序列能诱发产生广泛交叉保护作用的中和抗体[16-19]；E7序列较E6更为保守，而且更容易获得高水平的表 达[20]，因此选择L2和E7蛋白作为HPV16治疗性疫苗的靶抗原。

大肠杆菌由于其遗传背景清楚、成本低廉、生产率高、操作简单成为克隆和表达外源基因的首选[21-22]，但是由于种属特异性等原因，外源蛋白在大肠杆菌中表达往往存在表达量低、表达产物活性低或者以无活性的包涵体形式存在，给后续的纯化和复性带来了极大的挑战[23]。经过几十年的发展，大量商用的表达载体及配套菌株可供选择，为了获得高表达的具有活性的目的蛋白用于后续的研究以及产业化，需要考虑多方面的因素，包括密码子的偏好性、表达载体和表达宿主菌的筛选、表达条件的优化 等[22,24]。合作单位前期构建了表达系统pET30a-HPV16/BL21(DE3)，表达的蛋白经动物实验证明了具有抗肿瘤移植的作用[25]。但是表达量偏低，难以满足产业化的要求，因此，本研究首先进行了密码子优化，用大肠杆菌的偏爱密码子替换了原始密码子，从基因层面上提高了密码子的适应性。表达载体及菌株的选择也是影响蛋白表达的因素之一，优化后的基因分别选用3个不同体系的表达载体和相应的菌株来进行表达量的筛选，筛选的结果显示：与基因密码子优化前的原始菌株pET30a- HPV16/BL21 (DE3) 相比，菌株pET41a- HPV16/BL21 (DE3) 目的蛋白的表达量得到了明显的提高。

获得高表达菌株pET41a-HPV16/ BL21 (DE3) 后，本实验在摇瓶上选择接种量、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间几个参数进行了优化，为后续的高密度发酵提供了初步依据。接种量的大小直接影响发酵周期，采用稍大的接种量可以缩短菌体生长的迟滞期，明显缩短发酵时间，但太大的接种量会因为带入过多的代谢废物，反而影响菌体的生长。从图3结果可以看出，除了0.5%的接种量，2%、4%和6%的接种量菌体的生长速度差不多，培养4 h内均已进入对数生长期，因此在发酵罐上进一步摸索5%和10%的接种量，以期通过提高接种量在一定的时间内获得更高的菌体密度，最终提高产物的比生产率 (单位体积单位时间内产物的产量)，但是发现过高的菌体密度造成了目的蛋白相对表达量的降低，同时增大了发酵体系的负担，因此选择5%的接种量。IPTG为异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂，可与阻遏物结合促进基因的表达。以IPTG作为诱导剂，其作用是与阻遏物结合，起解阻遏作用。因此当所加入的IPTG量足以封闭所有阻遏物位点时，即为理论上的最佳浓度。IPTG浓度过高时，对菌体具有一定的毒性作用，影响细胞的繁殖和生长。对于带普通T7启动子载体，终浓度为0.4 mmol/L的IPTG可以实现完全诱导，而带有T7启动子的载体则需要终浓度为1 mmol/L的IPTG才能完全诱导。pET-41a为带有T7启动子的载体，理论上需要1 mmol/L的IPTG才能完全诱导。摇瓶实验结果表明0.5和1.0 mmol/L的IPTG浓度诱导的目的蛋白表达量明显高于0.1 mmol/L，综合考虑发酵培养时的菌体密度较高，所以选择终浓度为 1 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间则根据实验结果定为4 h。

HPV16 L2E7蛋白是以不溶的包涵体形式表达的，表达的蛋白因为错误折叠、二硫键错配等原因需要变性溶解后复性获得活性蛋白，尽管37 ℃和30 ℃诱导的总表达量无明显差异，但是30 ℃诱导表达的蛋白从包涵体纯度、变性容易程度以及复性率上高于37 ℃诱导表达的蛋白，这可能是由于37 ℃诱导蛋白表达速率过高，造成蛋白错误折叠率高有关，低温诱导有利于提高蛋白的折叠率从而提高蛋白的可溶性及活性。后期进行的25 ℃、30 ℃和37 ℃诱导表达结果表明，30 ℃和37 ℃诱导表达的蛋白还是以包涵体为主，25 ℃诱导表达的蛋白则呈现胶体状，需要长时间的离心才能分离，蛋白的可溶性和纯度明显提高，但是25 ℃诱导在得率上降低明显，而且诱导时间大大延长，不利于后期产业化的工艺。大肠杆菌表达的变性蛋白的复性方法有透析复性、稀释复性和层析柱上复性等[26-27]，近年来层析柱上复性由于效率高且兼具纯化作用而成为研究热点[28]，本实验通过 Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱上复性的方法，获得了可溶的具有免疫活性的目的蛋白，但是复性率偏低，未复性的蛋白在柱上沉淀吸附，今后将进一步优化复性条件以提高复性得率。

本实验制备的蛋白在小鼠荷瘤模型上显示出特异性的抑制肿瘤作用且具有剂量效应，与PBS对照组和HPV16 L2E7+CpG 30 μg组相比，HPV16 L2E7+CpG 60 μg以上即具有显著的抑瘤效果，但是最终还是有25%的小鼠诱发肿瘤，说明单独免疫一定剂量的融合蛋白疫苗诱发的免疫反应有限，今后进一步加大剂量以及与病毒载体疫苗等其他类型的疫苗联合免疫将有助于提高免疫效果。

REFERENCES

[1] Ferlay J,Shin HR,Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer, 2010, 127(12): 2893–2917.

[2] WHO/ICO information centre on HPV and cervical cancer (HPV Information Centre). Human papillomavirus and related cancers in world. Summary Report 2010[EB/OL]. [2010-06-22]. http://www.who.int/hpvcentre.

[3] Arbyn M,Castellsagué X,de Sanjosé S, et al. Worldwide burden of cervical cancer in 2008. Ann Oncol, 2011, 22(12): 2675–2686.

[4] Eklund C, Forslund O, Wallin KL, et al. The 2010 global proficiency study of human papillomavirus genotyping in vaccinology.J Clin Microbiol, 2012, 50(7): 2289-2298.

[5] Doorbar J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clin Sci (Lond), 2006, 110(5): 525–541.

[6] Siddiqui MA,Perry CM. Human papillomavirus quadrivalent (types 6, 11, 16, 18) recombinant vaccine (Gardasil). Drugs, 2006, 66(9): 1263–1271.

[7] Paavonen J,Jenkins D,Bosch FX, et al. Efficacy of a prophylactic adjuvanted bivalent L1 virus-like-particle vaccine against infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: an interim analysis of a phase III double-blind, randomised controlled trial. Lancet, 2007, 369(9580): 2161–2170.

[8] Schiller JT,Lowy DR. Papillomavirus-like particle based vaccines: cervical cancer and beyond. Expert Opin Biol Ther,2001, 1(4): 571–581.

[9] Lacey CJ,Thompson HS,Monteiro EF, et al. Phase IIa safety and immunogenicity of a therapeuticvaccine, TA-GW, in persons with genital warts. J Infect Dis,1999, 179(3): 612–618.

[10] Albers AE, Kaofmann AM. Therapeutic human papillomavirus vaccination. Public Health Genoics, 2009, 12(516): 331–342．

[11] Stanley MA. Genital human papillomavirus infections: current and prospective therapies. J Gen Virol,2012, 93 (Pt 4): 681–691.

[12] Münger K,Phelps WC,Bubb V, et al. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes. J Virol, 1989, 63(10): 4417–4421.

[13] Luo WF, Han LQ, Ren J, et al. Transforming activities of the mutants of HPV16 E6 and E7 gene for Balb/c 3T3 cells. Chin J Virol, 2002, 18(2): 97–101 (in Chinese).骆卫峰, 韩立群, 任皎, 等. 人乳头瘤病毒E6和E7基因及其突变体转化活性的研究. 病毒学报, 2002, 18(2): 97–101.

[14] Zhi HJ, Han LQ, Ren J, et al. Modification of HPV type 16 E6 and E7 genes, and analysis of stability and immunogenicity of the modified proteins. Chin J Exp Clin Virol, 2002, 16(2): 124–127 (in Chinese).职慧军, 韩立群, 任皎, 等. 人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析. 中华实验和临床病毒学杂志, 2002, 16(2): 124–127.

[15] Zhang H, Zhao L, Gao J, et al. Prokaryotic expression and purification of human papillomavirus type 11 L2E7 fusion protein vaccine and its immunogenicity. Chin J Exp Clin Virol, 2007, 21(2): 156–158 (in Chinese).张卉, 赵莉, 高见, 等. HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察. 中华实验和临床病毒学杂志, 2007, 21(2): 156–158.

[16] Day PM,Gambhira R,Roden RB, et al. Mechanisms of human papillomavirus type 16 neutralization by L2 cross-neutralizing and L1 type-specific antibodies. J Virol,2008, 82(9): 4638–4646.

[17] Kawana K, Matsumoto K, Yoshikawa H, et al. A surface immunodeterminant of human papillomavirus type 16 minor capsid protein L2. Virology, 1998, 245(2): 353–359.

[18] Kawana K,Yasugi T,Kanda T, et al. Safety and immunogenicity of a peptide containing the cross-neutralization epitope of HPV16 L2 administered nasally in healthy volunteers. Vaccine, 2003, 21(27–30): 4256–4260.

[19] Gambhira R, Karanam B, Jagu S, et al. A protective and broadly cross-neutralizing epitope of human papillomavirus L2. J Virol, 2007, 81(24): 13927–13931.

[20] Zehbe I, Wilander E, Delius H, et al. Human papillomavirus 16 E6 variants are more prevalent in invasive cervical carcinoma than the prototype. Cancer Res, 1998, 58(4): 829–833.

[21] Nuc P, Nuc K. Recombinant protein production in.–

[22] Panda AK. Bioprocessing of therapeutic proteins from the inclusion bodies of. Adv Biochem Eng Biotechnol,2003, 85: 43–93.

[23] Gopal GJ, Kumar A. Strategies for the production of recombinant protein in. Protein J,2013, 32(6): 419–425.

[24] Baneyx F. Recombinant protein expression in. Curr Opin Biotechnol,1999, 10(5): 411–421.

[25] Fan JT,Zhao L,Chen XQ,et al. The experimental study of HPV16 vaccines in prime-boost strategy. Chin J Microbiol Immunol,2006, 26(6): 510–515 (in Chinese).范江涛, 赵莉, 陈心秋, 等. 人乳头状瘤病毒16型不同基因疫苗联合免疫的实验研究. 中华微生物和免疫学杂志, 2006, 26(6): 510–515.

[26] Gong PS, Luo GM. Recent progress in renaturation of inclusion bodies. China Biotechnol, 2003, 23(12): 73–77; 94 (in Chinese).龚平生, 罗贵民. 包涵体复性研究进展. 中国生物工程杂志, 2003, 23(12): 73–77; 94.

[27] Misawa S, Kumagai I. Refolding of therapeutic proteins produced inas inclusion bodies. Biopolymers (Peptide Science), 1999, 51(4): 297–307.

[28] Gu ZY, Weidenhaupt M, Ivanova N, et al. Chromatographic methods for the isolation of, and refolding of protein from,inclusion bodies. Protein Expre Purif, 2002, 25(1): 174–179.

(本文责编郝丽芳)

Optimized expression, preparation of human papillomavirus 16 L2E7 fusion protein and its inhibitory effect on tumor growth in mice

Yunshui Jiang1, Jianbo Li1, Meng Gao1, Jiao Ren2, Sufeng Jin1, Gang Chen1, Jie Wu1, Fangcheng Zhuang1, and Houwen Tian2

1,,,310052,,2,,102206,

HPV16 L2E7 is a fusion protein used for therapeutical vaccine targeting HPV virus. To increase its expression in, we optimized the codon usage of HPV16gene based on its codon usage bias. The optimized gene of HPV16was cloned into three different vectors: pGEX-5X-1, pQE30, ET41a, and expressed in JM109, JM109 (DE3) and BL21 (DE3) lines separately. A high expression line was selected with pET41a vector in BL21 (DE3) cells. After optimization of the growth condition, including inoculation amount, IPTG concentration, induction time and temperature, the expression levelof HPV16 L2E7 was increased from lessthan 10% to about 28% of total protein. HPV16 L2E7 protein was then purified from 15L culture by means of SP Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow and Superdex 200 pg. After renaturing, HPV16 L2E7 protein with ≥95% purity was achieved, which was confirmed via SDS-PAGE gel and Western blotting. The combined use of purified HPV16 L2E7 and CpG helper has shown clear inhibition of tumor growth in mice injected with tumor cells, with six out of eight mice shown no sign of tumor. Thisstudy lays a solid foundation for a new pipeline of large-scale vaccine production.

human papillomavirus 16, optimized expression, fermentation, purification, uterine cervica cancer, vaccines

July 23, 2014; Accepted:September 22, 2014

Fangcheng Zhuang. Tel/Fax: +86-571-88861601; E-mail: fczhuang@163.com Houwen Tian. Tel/Fax: +86-10-58900881; E-mail:houwent@126.com

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA02Z490), Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province (No. 2012F10005).

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2006AA02Z490)，浙江省科技计划 (No. 2012F10005) 资助。

网络出版时间：2014-10-10

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140390.html