5株生姜促生菌的初步鉴定及产IAA和抑菌能力测定

王西祥+徐坤+张冬梅等

摘要：为明确5株生姜促生菌的分类地位和促生活性，本试验通过观察其菌体及菌落形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，初步确定GJ3为解淀粉芽孢杆菌，GJ130为纳什维尔链霉菌，NS87为非脱羧勒克氏菌，NS178为枯草芽孢杆菌，NS111为路德维希肠杆菌。用抑菌谱法测定了5株促生菌的拮抗特性，其中GJ3和NS178具有较广的抑菌谱，对14种病原真菌均具有拮抗效果。Salkowski比色法定量测定了5株促生菌产吲哚乙酸能力，菌株NS111产吲哚乙酸能力最强，其发酵液IAA含量为148.80 mg/L 。

关键词：生姜；吲哚乙酸产生菌；拮抗；16S rDNA

中图分类号：S476. 1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0036-06

Abstract In this research， the thallus and colony morphology characters， physiology and biochemistry properties and 16S rDNA sequence of five ginger growth-promoting bacteria were observed and analyzed. The strain GJ3， GJ130， NS87， NS178 and NS111 were identified as Bacillus amyloliquefaciens， Streptomyces nashvillensis， Leclercia adecarboxylata， Bacillus subtilis and Enterobacter ludwigii respectively. In addition， the antibacterial capacities of five strains were determined by antibacterial spectrum method. Among which， the strain GJ3 and NS178 had extensive antimicrobial spectrum， which both showed antagonism effects on 14 kinds of pathogenic fungi. The indole acetic acid （IAA）-producing abilities of five strains were also measured using Slkowski colorimetry. The strain NS111 had the best IAA-producing ability， whose IAA content of the fermentation liquid reached 148.80 mg/L.

Key words Ginger； IAA-producing strain； Antagonism； 16S rDNA

促生菌是指能够促进作物生长的一类细菌、放线菌和真菌的统称。目前，根据其来源不同主要分为两类，一类是从植物根际分离得到的菌株；一类是从植物组织中分离得到的菌株。促生菌可以帮助植物从环境中摄入某种养分，进行直接促生，也可以通过减轻或预防不良环境因素（如病原菌、重金属等）给植物造成的伤害而间接促生[1]。促生菌的作用机制主要包括：（1）产信号物质，如吲哚乙酸、细菌分裂素和乙烯；（2）产铁载体、抗生素抑制病原菌；（3）非共生固氮，一些PGPR能促使共生固氮结瘤，从而间接促进植株生长。然而，促生菌和植物的互作关系往往并不稳定，成功的实验室试验并不一定在田间原位成功[2]。这种不稳定性源于不同环境条件对细菌生长造成的影响，从而制约其促生效果，包括地域、气象、土壤性质、植物特性或土著微生物活力等[3]。

近年来，国家越来越重视环境质量，开发替代化学杀虫剂的新型生物杀菌剂成为必然，1964年至今，针对生姜病害，曾经试验过的拮抗微生物包括无致病力产细菌素的青枯病菌、荧光假单胞杆菌、放线菌、芽孢杆菌、噬菌体和木霉等[4]。徐莹莹等[5]从生姜根际土样分离筛选出对姜瘟病有良好拮抗效果的HI6-8短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、WF1弗雷德氏链霉菌（Streptomyees fradiae）和JW02-6劳伦链霉菌（Streptomyces laurentii）。王小兵等[6]从病区健康花生植株茎秆分离到1株对花生青枯病（Ralstonia solanacearum）有强拮抗作用的内生细菌BZ6-1，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。李文英等[7]从香蕉根际土壤分离筛选了芽孢杆菌PAB-1、PAB-2，并测定了菌株制剂对香蕉幼苗生长、养分吸收利用和香蕉枯萎病防治的效应。

尽管国内外已经分离到诸多促生细菌，但针对于生姜并且能在山东生姜产区很好定植的菌种资源未见报道。本文对从生姜土壤和组织中分离的5株促生菌进行形态特征观察、生理生化特性测定及16S rDNA序列分析，初步确定其分类地位，并测定其拮抗能力及产吲哚乙酸能力，以期为生姜专用生物肥料的研制提供了菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 5株供试菌株从泰安市邱家店生姜试验田分离得到，其中GJ3和GJ130分离于生姜根际土壤；NS87、 NS178和NS111分离于生姜块茎。

指示菌：烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、甘草链格孢叶斑病原菌（Alternaria azukiae）、生姜茎腐病原菌（Pythium myriotylum）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、烟草炭疽病菌（Colletotrichum nicotianae）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. cucumeris）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. niveum）、腐皮镰孢菌（Fusarium solani）、黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）、芹菜斑枯病菌（Septoria apiicola）、苹果叶枯病菌（Rhizoctonia solani）、茄子黄萎病原菌（Verticillium dahliae）、牡丹根腐病原菌（Fusarium solani Sacc.）、青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）和瓜疮痂枝孢霉菌（Cladosporium cucumerinum Ell.）等15种病原菌为本实验室保存。endprint

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯蔗糖固体培养基。

1.1.3 主要试剂和仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、Buffer、PCR 产物纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。

Eppendorf centrifuge 5810R 离心机（Eppendorf 公司）；DYY-8C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；T-Gradient 96 PCR 仪（德国 Biometra 公司）；美国 UVP 凝胶成像系统；超低温冰柜（Haier 公司）。

1.1.4 16S rDNA扩增引物 正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT -3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 菌种鉴定

1.2.1 形态观察 根据《常见细菌系统鉴定手册》[8]中的方法进行形态观察。

1.2.2 生理生化特性测定 生理生化特性测定所需试剂参见文献[8]，包括生长温度（4℃、20℃、30℃、50℃、55℃、65℃）、耐盐性（2%、5%、7%、10%）、接触酶、V-P测定、甲基红、水解明胶、碳源利用（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、乳糖、甘油、山梨醇、蔗糖）、氮源利用（赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、L-苏氨酸、D-苏氨酸）、淀粉水解、形成吲哚、柠檬酸利用等30项。

1.2.3 16S rDNA序列测定及系统发育树的构建 CTAB法[9]提取待测菌株的总DNA，并作为模板进行PCR 扩增。扩增反应体系为：10×PCR缓冲溶液（Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2.0 μL，引物（5 μmol/L）各2.0 μL，模板（约50 mg/L）1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加ddH2O定容至25 μL。反应条件：95℃预变性10 min，94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min（30个循环），72℃延伸10 min。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

将16S rDNA测序结果去载体后提交GenBank获得登录号为KC312154、KF958192、KC312155、KC312156和 KC312157，并在NCBI数据库进行BLAST比对分析，根据菌株与数据库模式菌株的同源性高低，使用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.3 抑菌谱试验

以15种病原菌为指示菌，利用平板对峙法测定供试菌的拮抗能力。在PDA平板中央接种指示菌，四周接种供试菌，每组试验重复3次，以菌落半径与抑菌带宽度确定供试菌的拮抗能力。

1.4 IAA定量测定

向含有L-色氨酸（200 mg/L）的LB液体培养基中接菌，28℃、180 r/min培养4 d。分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30 min使其显色，测定其OD530值。计算单位体积发酵液中IAA的含量。IAA标准曲线的绘制，采用分析纯的IAA梯度稀释制备。

2 结果与分析

2.1 5株菌的形态学特征

5株菌的形态特征见表1。其中GJ3、GJ130、NS178为革兰氏阳性菌；GJ3和NS178能产生芽孢。经初步观察，GJ130为放线菌，呈较长的细丝状，与其它4株菌明显不同。GJ3与NS178结构形态最接近。显微镜下观察每株菌都均匀分布、形态特征稳定。

2.2 5株菌的生理生化特性分析

将5株菌的16S rDNA 测序结果进行BLAST比对，各自选择同源性最高的模式菌株。经测定，5株菌与模式菌种的多数生理生化指标特性相似，少数特性存在差异，如GJ3能利用乳糖而模式菌株M1（B. amyloliquefaciens）未测定，GJ3菌株V-P测定阳性，而模式菌株M1呈现不稳定性；GJ130在55℃和65℃生长不稳定，而模式菌株M2（S. nashvillensis）不生长；NS87能利用甘油，而模式菌株M3（L. adecarboxylata）不能利用甘油等，这些少数差异性特性可能是由于菌株生存的不同环境造成的，也可能与差异性表达有关。5株菌的主要生理生化特性见表2。

2.3 5株菌16S rDNA序列测定及相似性分析

根据系统发育树（图1），结合菌株的形态学以及生理生化特性，初步鉴定GJ3、GJ130、NS87、NS111、NS178分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、纳什维尔链霉菌（Streptomyces nashvillensis）、非脱羧勒克氏菌（Leclercia adecarboxylata）、路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），相似度均达99%。

2.4 抑菌谱

对5株菌进行了培养皿内拮抗试验，部分拮抗效果如图2所示。依据供试菌对指示菌抑菌带宽度（R2）与供试菌菌落半径（Rl）比值，计算供试菌的拮抗能力（R2/R1）。依据拮抗能力：阴性记为“-”；02.5记为“++++”，抑菌圈直径15 mm以上。5株菌的拮抗性能见表3。

抑菌谱测定结果说明GJ3和NS178均对10种以上的病原菌有拮抗作用，具有较广抗菌谱，R2/R1在1.0和3.0之间，拮抗能力较强；GJ130和NS87对青枯病原菌和茄霜枯叶病病原菌有较好的拮抗效果。

2.5 菌株产IAA测定结果

经Salkowski比色法测定，NS111菌株发酵液中IAA的含量为148.80 mg/L，其它菌株没有检测到吲哚乙酸的产生。

3 结论与讨论

本试验对5株生姜促生菌进行初步鉴定，将GJ3确定为解淀粉芽孢杆菌，GJ130为纳什维尔链霉菌，NS87为非脱羧勒克氏菌，NS178为枯草芽孢杆菌，NS111为路德维希肠杆菌，其中有两株为芽孢杆菌。芽孢杆菌是应用比较广泛的一类生防微生物。一些研究表明，解淀粉芽孢杆菌还能产生抗菌蛋白、伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin）、芬荠素（fengycin）和杆菌霉素（bacillomycin）等抑菌物质，抑菌谱广，特别是对于霉菌有较好的抑制作用[10]。崔堂兵等[11]2007年对枯草芽孢杆菌BS-06抑菌谱进行研究，其对5种病原菌有较好的抑菌效果，抑菌圈直径为11.3～19.8 mm。刘莹等[12]对分离的5株芽孢杆菌进行了5种病原菌的皿内拮抗试验，只有50%抑菌直径达到10 mm。GJ3、NS178的抑菌谱较广，GJ3 的拮抗能力最强，50%抑菌圈直径大于15 mm，抑菌效果明显优于上述分离菌株。GJ130为纳什维尔链霉菌，对青枯病病原菌有较强拮抗作用。冉红艳等[13]得到了相似的结果，他们2005年分离获得的一株链霉菌SR-11对姜瘟病有拮抗作用。

Shoebitz等[14]2009年首次将分离鉴定的E. ludwigii作为生防菌，并测定了菌株产吲哚乙酸能力为30 mg/L。张振粉等[15]2011年从番茄产区采集疫病样品并分离4株产吲哚乙酸菌株XA7、XB3、ZA14和ZHC11，培养液加色氨酸时，菌株分泌IAA的浓度为3.84～25.74 mg/L。Liu等[16]2012年在白三叶根际分离筛选3株勒克氏菌，菌株RW2分泌IAA量最高，为12.69 mg/L。Abd-Alla 等[17]2013年从小麦和玉米的根际土壤中筛选出12株链霉菌属，产生IAA的最高水平为3.5～22.5 mg/L 。另有文献报道植物激素IAA对艳山姜种子发芽势、发芽率及活力指数均有提高[18]。本试验测定了路德维希肠杆菌NS111产吲哚乙酸量达到148.80 mg/L，在农业生产中具有较大的应用潜力。

本研究报道的5株促生菌分离自生姜产区，更有利于其在生姜根际的定植，研究结果为生姜专用生物肥料提供了菌种资源。

参 考 文 献：

[1]康贻军， 程杰， 梅丽娟， 等. 植物根际促生菌的筛选及鉴定[J]. 微生物学报， 2010， 50（7）： 853-861.

[2]Chanway C P， Holl F B. First year field performance of spruce seedlings inoculated with plant growth promoting rhizobacteria[J]. Canadian Journal of Microbiology， 1993， 39（11）： 1084-1088.

[3]Ahmad F， Ahmad I， Khan M S. Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities[J]. Microbiological Research， 2008， 163（2）： 173-181.

[4]严金平， 泽桑梓， 张火云， 等. 姜细菌性青枯病病原菌及其防治研究进展[J]. 河南农业科学， 2004（9）： 63-65.

[5]徐莹莹， 杜秉海， 丁延芹， 等. 生姜根际姜瘟病拮抗菌的筛选及鉴定[J]. 山东农业科学， 2012， 44（1）： 79-83.

[6]王小兵， 骆永明， 刘五星， 等. 花生青枯病内生拮抗细菌的鉴定、抗菌活性及其田间防效[J]. 中国生物防治学报， 2011， 27（1）： 88-92.

[7]李文英， 彭智平， 杨少海， 等. 植物根际促生菌对香蕉幼苗生长及抗枯萎病效应研究[J]. 园艺学报， 2012， 39（2）： 234-242.

[8]东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学技术出版社， 2001.

[9]Sambrook J， Fritsch E F. Molecular cloning： Alaboratory manual[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989.

[10]Koumoutsi A， Chen X H， Henne A， et al. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2004， 186（4）： 1084-1096.

[11]崔堂兵， 刘煜平， 舒薇， 等. 枯草芽孢杆菌BS-06液体发酵生产农用抑真菌素的初步研究[J]. 江西农业学报， 2007， 19（10）： 78-80.

[12]刘莹， 孙荣丹， 杨翔华， 等. 5株芽孢杆菌的分离鉴定、拮抗性试验与抑菌效价测定[J]. 中国农学通报， 2006， 22（5）： 32-34.

[13]冉红艳， 葛绍荣， 刘世贵， 等. 一株拮抗姜瘟病青枯假单胞杆菌的链霉菌的分离及鉴定[J]. 微生物学报， 2005， 45（3）： 325-328.

[14]Shoebitz M， Ribaudo C M，Pardo M A， et al. Plant growth promoting properties of a strain of Enterobacter ludwigii isolated from Lolium perenne rhizosphere[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2009， 41（9）： 1768-1774.

[15]张振粉， 陈秀蓉. 牧草内生枯草芽孢杆菌的功能多样性及其16S rDNA鉴定[J]. 甘肃农业大学学报， 2010， 39（3）： 63-66.

[16]Liu X X， Lu R X， Wang X L， et al. Selection，identification and growth promotion of inorganic phosphorus-dissolving bacterial strains in rhizosphere of Trifolium repens[J]. Agricultural Biotechnology， 2013， 13（10）： 2058-2064.

[17]Abd-Alla M H， El-Sayed E A， Rasmey A M. Indole-3-acetic acid（IAA） production by Streptomyces atrovirens isolated from rhizospheric soil in Egypt[J]. J. Biol. Earth Sic.，2013（3）：182-193.

[18]曾亚军， 周仕林. 植物激素对艳山姜种子发芽的影响[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（26）： 1245-1248.endprint