虾蛄多肽酶解工艺的优化及其体外免疫活性研究

卜天　马剑茵

摘要[目的] 研究虾蛄多肽的免疫活性。[方法] 采用胰蛋白酶水解虾蛄的生物组织，通过单因素试验和正交试验探索其最佳酶解条件，采用MTT试验研究虾蛄多肽对小鼠巨噬细胞的细胞活性，并通过中性红吞噬试验分析虾蛄多肽的免疫调节能力。[结果] 虾蛄多肽的最佳酶解条件为：温度62.5 ℃、pH 9.5、酶解时间8 h、加酶量0.08%，此时虾蛄多肽对RAW264.7有最高的细胞活性，并对小鼠巨噬细胞的吞噬能力表现出一定的促进作用。[结论] 该研究为从海洋蛋白中获取高生物活性的酶解产物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科学依据。

关键词虾蛄多肽；胰蛋白酶；酶解条件；免疫活性

中图分类号S917文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-139-02

虾蛄（Oratosquilla oratoria）隶属节肢动物门[1]、甲壳纲、软甲亚纲、口足目、虾蛄科口虾蛄属，又名皮皮虾、东方虾蛄、富贵虾、濑尿虾等，广泛分布在我国、日本以及东南亚的沿海地区。我国南北沿海等地均有大量生产。虾蛄肉质鲜美，营养丰富，物美价廉，深受消费者喜爱。从海洋生物中提取到的多肽，其功能活性主要集中在抗菌、抗氧化、免疫调节、抑制胰岛细胞凋亡及改善胰岛素抵抗、降血压、降血脂、增强骨质强度及预防骨质疏松、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖及抗血管生成等方面[2-5]。目前，关于虾蛄药用价值的研究有口虾蛄乙酸乙酯提取物与阿霉素或顺铂联合作用对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制[6]，口虾蛄提取物对人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2的迁移及体外血管生成拟态的抑制作用[7]等。有关虾蛄的研究中大多是提取其酶解液进行肿瘤抑制试验，然而关于虾蛄酶解液对免疫细胞作用的研究还不多。笔者采用虾蛄为原料，用胰蛋白酶作为水解酶，以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活性作为多肽活性指标，采用正交试验方法探讨其最佳酶解条件，提取多肽，同时通过小鼠巨噬细胞中性红吞噬试验探索虾蛄多肽的免疫活性。

1材料与方法

1.1原料与试剂

新鲜虾蛄采集自浙江省舟山市附近海域；胰蛋白酶（购自国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠，购自无锡市晶科化工有限公司，分析纯；盐酸（36%～38%），购自国药集团化学试剂有限公司，优级纯；二甲基亚砜（DMSO）、MTT试剂、中性红试剂，均购自美国Sigma公司。

1.2仪器

DS-1高速组织捣碎机，为上海标本模型厂产品；BS110电子分析天平，为北京赛多利斯天平有限公司产品；PHS-250精密pH计，为上海精密科学仪器有限公司产品；SSW-420-2S恒温水浴锅，为上海一恒科学仪器有限公司产品；LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司产品；CF16RXⅡ高速冷冻离心机，日本日立公司产品。

1.3试验方法

1.3.1

MTT法检测虾蛄多肽对细胞活性的影响。取对数生长期的小鼠巨噬细胞制成细胞悬液，接种至96孔板，每孔200 μl，设置5个平行孔，于5% CO2、37 ℃条件下贴壁12 h，置于倒置显微镜下观察，并弃去培养液，同时将虾蛄酶解液冻干粉以10 mg/ml溶于培养液中。然后分别加入每个孔，同时设置不加样品的空白对照组，置于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h，加入含有MTT的培养液，继续培养4 h。终止培养，离心并去除上清液。每孔加入二甲基亚砜100 μl，并置于摇床上低速振荡15 min，采用酶联免疫检测仪于波长570 nm处测定各孔的吸光值（A值），以A值大小表示小鼠巨噬细胞代谢活性的强弱[8]。

1.3.2

单因素试验探索酶解工艺条件。用高速组织捣碎机将虾蛄组织捣碎匀浆，用缓冲液调pH，加入胰蛋白酶酶解数小时，100 ℃下灭酶15 min，于4 ℃下离心15 min（10 000 r/min）并取上清液，采用MTT法测定酶解液对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活性的影响。采用单因素试验分析酶解温度、pH、时间及加酶量对细胞活性的影响，并初步确定酶解法制备虾蛄多肽的工艺条件。

1.3.3

酶解虾蛄多肽工艺的优化。在单因素试验的基础上，运用正交设计试验优化酶解工艺条件，并采用MTT法测测小鼠巨噬细胞活性。

1.3.4

中性红法检测虾蛄多肽免疫调节活性。

取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7制成浓度为106个/cell的细胞悬液，接种至96孔板，每孔200 μl，设5个平行孔，于5% CO2、37 ℃条件下贴壁3 h，倒置显微镜下观察，弃去培养液，同时将上述最佳酶解条件下制备的虾蛄酶解液以梯度浓度分别溶于培养液中，每孔150 μl。另外，设置不加样品的空白对照组和加入LPS（1 mg/L）拟细胞炎症反应的阳性对照组。置于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育48 h，每孔再加入0.1%中性红溶液50 μl，继续培养3 h，终止培养后离心并吸弃上清液，用 PBS 洗涤 3 次，每孔加入 100 μl 细胞裂解液（乙酸∶无水乙醇=50∶50），4 ℃下静置过夜，使用酶标仪于540 nm处测定吸光度A值。以A值大小表示巨噬细胞吞噬功能的强弱[9-10]。以试验组A值与空白组A值的比值表示虾蛄多肽作用下对巨噬细胞吞噬能力的促进率，按照以下公式进行计算：

促进率=A试验组/A空白组×100%。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1

温度对虾蛄酶解产物的影响。从图1可以看出，随着酶解温度的增加，小鼠巨噬细胞细胞活性（A值）不断增加，当酶解温度为60 ℃时A值达到最大值。

图1 酶解温度对小鼠巨噬细胞活性的影响

2.1.2

pH对虾蛄酶解产物的影响。从图2可以看出，随着pH的升高，小鼠巨噬细胞活性不断增加，并在pH为10时达到最大值，此后开始降低。

图2酶解pH对小鼠巨噬细胞活性的影响

2.1.3

酶解时间对虾蛄酶解产物的影响。从图3可以看出，小鼠巨噬细胞活性（A值）随着酶解时间的增长而升高，当酶解8 h后A值最大，此后A值随着酶解时间的增长而降低。

图3酶解时间对小鼠巨噬细胞活性的影响

2.1.4

加酶量对虾蛄酶解产物的影响。从图4可以看出，随着加酶量的增长，小鼠巨噬细胞（A值）不断降低，当加酶量为0.12%时（A值）最大。

图4加酶量对小鼠巨噬细胞活性的影响

2.2正交试验优化酶解工艺条件

由表5可知，各因素对胰蛋白酶酶解虾蛄的影响程度依次为温度>加酶量>pH>时间。温度是优化条件中影响最大的因素，加酶量次之，而时间的影响最小。最佳酶解工艺条件为：酶解温度62.5 ℃，pH为9.5，酶解时间8 h，加酶量为0.08%。

表5酶解正交试验设计及结果

序号时间pH温度加酶量吸光值

11（7.5 h）1（9.5）1（57.5 ℃）1（0.08%）1.784

212（20）2（60 ℃）2（0.12%）2.114

313（10.5）3（62.5 ℃）3（0.16%）1.323

42（8 h）1232.344

522312.793

623111.512

73（8.5 h）1322.432

832131.602

933212.245

X11.7402.1871.6332.274

X22.2162.1702.2342.019

X32.0931.6932.2831.756

极差0.4760.4940.6010.518

2.3中性红吞噬试验结果

由表1可知，随着虾蛄多肽浓度的升高，阳性对照组及部分试验组的吸光度显著升高（P<0.05），小鼠巨噬细胞的吞噬能力逐渐增强，说明虾蛄多肽具有一定的免疫调节能力，但其增强作用低于阳性对照，即不会引起细胞炎症反应。

表1小鼠巨噬细胞RAW264.7中性红吞噬试验结果（x±S，n=5）

组别浓度∥mg/ml吸光值促进率∥%

空白0.092±0.004-

阳性对照（LPS）0.142±0.015*154

150.099±0.018107

2100.107±0.013116

3150.110±0.004119

4200.116±0.010*126

5250.115±0.008*125

注：*表示与空白对照组相比差异显著（P<0.05）。

3讨论

虾蛄生长于海洋世界，其多肽的氨基酸结构和组成均有其特殊性，为从海洋生物多肽酶解液中获得较高生物活性的多肽提供了可能性。笔者采用组织匀浆、酶解、冷冻离心等方法提取虾蛄活性多肽，中性红吞噬试验结果表明虾蛄经过酶解后具有一定的免疫活性。

笔者采用胰蛋白酶对虾蛄进行酶解，并对影响多肽酶解过程的各个因素及水平进行综合分析，酶解最佳条件为酶解温度62.5 ℃，pH为9.5，酶解时间8 h，加酶量0.08%。通过MTT试验和小鼠巨噬细胞中性红吞噬试验探索了虾蛄多肽的细胞活性与免疫活性，试验结果为更好地使用酶解从海洋蛋白中获取高生物活性的产物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科学依据，其免疫活性及其机制还有待于深入研究。

参考文献

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