RP—HPLC法同时测定六味地黄胶囊中3种成分含量

杨堃　郑小平　阮陶仁

摘要 [目的]建立同时测定六味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚3种成分含量的反相高效液相色谱法（RPHPLC）。[方法]以Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）柱为分析柱、甲醇-0.1%磷酸为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长芍药苷和马钱苷为230 nm、丹皮酚为274 nm，柱温40 ℃。[结果]芍药苷在0.066 5～1.663 2 μg、马钱苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范围内均具有良好的线性关系，相关系数（r）分别为0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率为芍药苷97.63%（RSD=0.82%）、马钱苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）。[结论]该方法简便、准确、重复性好，可用于六味地黄胶囊的质量控制。

关键词 六味地黄胶囊；芍药苷；马钱苷；丹皮酚；RPHPLC

中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-074-04

Simultaneous Determination of Three Constituents in Liuwei Dihuang Capusule by RPHPLC

YANG Kun1， ZHENG Xiaoping1， RUAN Taoren2*

（1. Chongqing Food and Drug Control Institute， Chongqing 401121； 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chongqing 401121）

Abstract [Objective] To establish RPHPLC method for simultaneous determining paeoniflorin， loganin and paeonol in Liuwei Dihuang Capsule. [Method] RPHPLC assay was carried out using a Waters ODS C18 （4.6 ×250 ，5 ） column.The mobile phase was consisted of methanol -0.1% phosphoric acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min.The UV detection wavelength was set at 230 for paeoniflorin and loganin，and 274 for paeonol.The column temperature was 40 ℃. [Result] The linear ranges of paeoniflorin， loganin and paeonol were 0066 5-1.663 2 （r=0.999 4 ）， 0.107 9-2.697 7 （r=0.9998 ）， 0.122 4-3.060 0 （r=0.999 9 ）， respectively. The average recoveries of paeoniflorin， loganin and paeonol were 97.63% （RSD was 0.82%） ， 97.66% （RSD was 0.74%） ， and 96.22% （RSD was 121%） ， respectively. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Dihuang Capsule.

Key words Liuwei Dihuang Capsule； Paeoniflorin； Loganin； Paeonol； RPHPLC

六味地黄胶囊是由滋阴补肾的经典代表方剂六味地黄丸改进制剂方法而成的，是《中国药典》2010版一部收載的常用复方制剂。六味地黄胶囊依然由熟地黄、酒萸肉、山药、牡丹皮、茯苓和泽泻六味中药组成，只是改进了制备方法，减少了服用量，易于保存和增加病人的依从性。所以六味地黄胶囊同样具有滋阴补肾的功效，可用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精的治疗[1]。喻箴等通过临床研究表明六味地黄胶囊总疗效明显优于传统剂型六味地黄丸[2]；韦咏莲也通过临床研究发现六味地黄胶囊治疗2型糖尿病有助于控制血糖，减轻病情[3]。

2010版《中国药典》记载采用高效液相色谱法测定六味地黄胶囊中丹皮酚的含量，用薄层扫描法测定熊果酸的含量[1]；迟富杰等采用HPLC法测定六味地黄胶囊中熊果酸含量[4-5]和丹皮酚的含量[6-7]；水彩红等采用HPLC法测定六味地黄胶囊中马钱苷的含量[8-9]和芍药苷的含量[10]。这些方法均是对单一成分的检查，而六味地黄胶囊中成分多，为提高其质量控制标准，笔者参考和改进了李向阳等对于六味地黄丸采用HPLC法进行含量测定的方法[11-12]，从而建立了同时测定六味地黄胶囊中芍药苷、马钱苷和丹皮酚3种成分的HPLC方法，为提高质量标准、全面评价其内在质量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 美国Waters2695型高效液相色谱仪；KQ500B型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；BP221S万分之一分析天平（德国Sartorius）；AX205十万分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

1.2 试药 六味地黄胶囊（吉林省抚松制药股份有限公司 0.3 g×24粒）；芍药苷对照品（中国食品药品检定所，定量测定用，批号110736-201136）；马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，定量测定用，批号110640-201005）；丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，定量测定用，批号110708-200505）；甲醇为色谱纯；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置。

1.3.1.1 对照品溶液的制备。取芍药苷和马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml分别含芍药苷66.528 0 μg、马钱苷107.906 5 μg的混合溶液，即得。取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含丹皮酚122.4 μg的溶液，即得。

1.3.1.2 供试品溶液的制备。取同一批次样品（批号120202 85），取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.3.2 色谱条件及系统适应性试验。色谱柱为Waters ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液系统，梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示；体积流量1.0 ml/min；进样量10 μl ；检测波长芍药苷和马钱苷为230 nm、丹皮酚为274 nm。

1.3.3 标准曲线的绘制。精密吸取“1.3.1.1”项下的2种对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl，分别注入液相色谱仪，测定芍药苷、马钱苷和丹皮酚峰面积，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 精密度试验。精密吸取“1.3.1.1”项下的2种对照品溶液，分别连续进样6次，进样体积为10 μl，测定马钱苷、芍药苷和丹皮酚峰面积，分别计算芍药苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.3.5 稳定性试验。取“1.3.1.2”项下同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、15 h注入液相色谱仪，进样体积为10 μl，测定芍药苷、马钱苷和丹皮酚峰面积，分别计算芍药苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的RSD。

1.3.6 重复性试验。取同一批次样品（批号120202 85），按“1.3.1.2”方法平行制备6份供试品溶液，分别测得芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量，并分别计算芍药苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的RSD。

1.3.7 加样回收率试验。取已测定的六味地黄胶囊样品（芍药苷0.377 0 mg/粒、马钱苷0.603 0 mg/粒、丹皮酚3.990 4 mg/粒），取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含芍药苷、马钱苷和丹皮酚对照品的混合甲醇溶液（芍药苷、马钱苷和丹皮酚的浓度分别为0.013 3、0.021 6、0.135 6 mg/ml）25 ml，以下按“1.3.1.2”项下制备方法操作，平行操作，制得6份加样供试品溶液。吸取加样供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，测定芍药苷、马钱苷和丹皮酚，计算加样回收率和RSD。

1.3.8 样品含量测定。按“1.3.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定3个厂家六味地黄胶囊中芍药苷、马钱苷和丹皮酚，平行测定3次，计算含量和RSD。

2 结果与分析

2.1 色谱条件及系统适应性试验 从图1可看出，该方法所得对照品色谱峰峰形尖锐，对称性好；供试品中的芍药苷和马钱苷色谱峰对称性好，与前后其他峰分离度>1.5，可见芍药苷、马钱苷和丹皮酚色谱峰与相邻成分可达基线分离，且阴性试验无干扰，理论板数按芍药苷峰计算不低于6 000，故该方法可行。

2.2 标准曲线的绘制

通过以上色谱条件测定，绘制标准曲线，数据经过回归处理，得芍药苷、马钱苷、丹皮酚的回归方程分别为Y=9.0×104X-419（r=0.999 4）、Y=1.5×105X-1.5×104（r=0.999 8）、Y=6.7×105X-7.9×104（r=0.999 9），表明芍药苷在0.066 5～1.663 2 μg、马钱苷在0107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范围内有良好的线性关系。

2.3 精密度试验 分别连续进样6次，进样体积为10 μl，测得马钱苷、芍药苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.57%、045%和0.30%，表明该方法的精密度良好。

安徽农业科学 2015年

2.4 稳定性试验 按“1.3.5”方法操作，测得芍藥苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.32%、0.55%和0.46%，表明供试品溶液在15 h内稳定性较好。

2.5 重复性试验 按“1.3.6”方法操作，测得芍药苷、马钱苷、丹皮酚的平均含量分别为0.377 0（RSD=0.28%）、0.603 0（RSD=0.57%）、3.990 4 mg/粒（RSD=1.20%），表明该方法重复性好。

2.6 加样回收率试验

由表2～4可见，芍药苷、马钱苷、丹皮酚的平均回收率分别为97.63%、97.66%、96.22%、RSD

分别为0.82%、0.74%、1.21%，均达到相关要求，说明该方

2.7 样品含量测定 由表5可见，吉林抚松、四川泰华堂、修正药业3个厂家的样品用该方法均能检出芍药苷、马钱苷和丹皮酚及其含量，表明该方法准确、可靠，可推广用于六味地黄胶囊的质量控制。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 试验前查参考文献[13]得知芍药苷、马钱苷和丹皮酚的最大吸收波长分别为230、236和274 nm。由于所用检测器为双波长检测器，故丹皮酚选择其最大吸收波长274 nm；而芍药苷的最大吸收波长230 nm与马钱苷的最大吸收波长236 nm比较接近，故通过试验选择芍药苷和马钱苷共用的波长。取同一供试品溶液进样10 μl，分别在230和236 nm波长下测定芍药苷和马钱苷的含量，结果显示（表6），由于230和236 nm 2个波长比较接近，所以含量测定时影响不大，但由于芍药苷含量比马钱苷低，所以选择了芍药苷的最大吸收波长230 nm为芍药苷和马钱苷的共用检测波长。

3.2 流动相的选择 由于是3种物质同时进行分离，芍药苷、马钱苷2个苷类物质的极性与丹皮酚酚酸类物质极性相差较大，如果仅采用等度洗脱，很难完全、快速地将3种物质分离，故采用梯度洗脱。开始水相的比例较大，流动相极性较大，将同样极性较大的芍药苷和马钱苷洗脱处理；然后再逐渐加大甲醇的比例，降低流动相极性，将极性较小的丹皮酚洗脱出来；最后由于六味地黄胶囊为中药复方提取物，杂质较多，反复进样，易导致色谱柱的柱效下降，且由于采用自动进样，连续进样后会出现杂质峰干扰，因此最后用高浓度甲醇溶液冲洗杂质一段时间。试验开始时使用的为0.05%的磷酸溶液，但芍药苷色谱峰拖尾现象严重，故加大酸性，采用0.1%的磷酸溶液，峰型因此变得比较对称。同时试验中发现，芍药苷与马钱苷的极性比较接近，最开始采用的为甲醇∶0.1%磷酸（25∶75），两峰大部分重合，逐渐增加水相比例，降低溶剂强度，比例为甲醇∶0.1%磷酸（20∶80）时才使两峰达到基线分离。

3.3 提取溶剂的选择

取同一批次样品（批号120202 85），取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和甲醇各25 ml，称定重量，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减少的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45微孔滤膜滤过，分别测定芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量。结果显示（表7），以甲醇为提取溶剂时马钱苷与丹皮酚的提取含量最高，以50%甲醇为提取溶剂时芍药苷的提取含量最高，从含量以及操作方面综合考虑，选择甲醇为提取溶剂，与2010版中国药典品种六味地黄胶囊采用溶剂无差别。

3.4 提取时间的选择

取同一批次样品（批号120202 85），取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，分别超声处理（500 W，40 kHz）20、30、40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别测定芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量。结果显示（表8），超声30 min基本已提取完全，故超声时间选择30 min。

3.5 小结

芍药苷、马钱苷和丹皮酚均具有明确的药理作用，属六味地黄胶囊方中的重要有效成分。该试验建立了同时测定六味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚3种成分含

量的反相高效液相色谱法（RPHPLC），结果表明，芍药苷在0.066 5～1.663 2 μg、马钱苷在0.107 9～2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4～3.060 0 μg范围内均具有良好的线性关系，相关系数（r）分别为0.999 4、0.999 8、0.999 9，平均回收率分别为芍药苷97.63%（RSD=0.82%）、马钱苷97.66%（RSD=0.74%）、丹皮酚96.22%（RSD=1.21%）。可见，六味地黄胶囊样品中丹皮酚的含量均符合中国药典2010版不得低于规定0.3 mg/粒的规定[1]。这样同时测定3个成分，能同时检测六味地黄胶囊中牡丹皮和酒萸肉的含量，更加方便、快捷和具有代表性。同時该方法稳定性和重复性好，可更科学、全面地用于六味地黄胶囊质量控制和评价。

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