分月扇舟蛾颗粒体病毒蛋白基因的序列测定和分析

李海霞　曹焱　白卉等

摘要[目的]分析分月扇舟蛾颗粒体病毒蛋白基因的序列。[方法]针对分月扇舟蛾颗粒体病毒granulin基因进行PCR扩增，分析其核苷酸组成和氨基酸序列。[结果]测序得到498 bp的核苷酸序列片断，GC含量47.9%，AT含量52.1%。该基因蛋白序列等电点为5.42，分子量1.981 9×104 Da。蛋白质的二级结构主要由α螺旋（38.55%）、β折叠（18.07%）、β转角（10.24%）和无规卷曲（33.13%）组成，其中，α螺旋为主要结构。[结论]分月扇舟蛾颗粒体蛋白基因与杨扇舟蛾的相似性最高，亲缘关系最近。

关键词分月扇舟蛾； 颗粒体蛋白基因；序列测定

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-032-03

分月扇舟蛾（Clostera anastomosis L.）是杨树的暴发性食叶害虫之一，在东北地区主要发生在杨树的人工林和次生林中，经常造成严重的危害[1]。分月扇舟蛾颗粒体病毒作为颗粒体病毒的一种，在农业病虫害防治中发挥了很大的作用，但其基因水平的研究较缺乏[2]，笔者首次报道了分月扇舟蛾颗粒体病毒的颗粒体蛋白基因，它的测定为以后其他基因的筛选以及分月扇舟蛾颗粒体病毒基因组文库的构建提供一定的参考价值。

1材料与方法

1.1试验材料

病毒的分离：从杨树林间采集病死幼虫，保存在4 ℃冰箱中。虫尸经过研钵研磨、三层纱布过滤，采用差速离心法纯化病毒。滤液先以800 r/s 低速离心20 min，离心3次，去掉沉淀，再以12 000 r/s高速对上清液离心30 min，离心3次，最后得到的白色沉淀即为纯化的GV[3]。

1.2试验方法

1.2.1蛋白基因的纯化和DNA的提取。

取纯化的病毒悬液，加400 μl碱解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.15 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 10.5），碱解2 h，加入SDS静置30 min，溶液变清，12 000 r/min离心5 min，取上清液，用500 μl酚、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）各抽提1次，上清液用2倍体积无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后得到的DNA沉淀溶于30 μl水中，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2蛋白基因的引物设计。

参照杨扇舟蛾颗粒体病毒（CacGV）、苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）、苜蓿绿叶蛾颗粒体病毒（PsGV）、云杉芽卷叶蛾颗粒体病毒（CmGV）、茶小卷叶蛾颗粒体病毒（AoGV）、美国白蛾颗粒体病毒（HcA5-1GV）蛋白基因设计兼并引物。

引物序列为上游：5′-CBGGHAARAAYGWDMGVATCAC-3′，

下游：5′-AACARDAGVGAYACYTCRATC-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3DNA序列测定及序列分析。

序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，核苷酸序列以及氨基酸序列的相似性分析软件为ClustalX（W），分析所用的各种颗粒体病毒数据均来自GenBank数据库。密码子偏向性分析运用欧洲分子生物学开放软件包（EMBOSS），运行chips和cusp程序对其进行计算及分析[4]；疏水性分析利用Bioedit软件采用Kyte和Doolittle算法[5]，联网至http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/对该蛋白序列进行跨膜区分析，二级结构预测采用SOPMA法[6-7]。

2结果与分析

2.1CaGV granulin基因的序列分析

CaGV granulin基因的核苷酸序列见图1。对测序所获得的序列进行核酸组成分析，测序得到498 bp的片断，GC含量47.9%，AT含量52.1%。

2.2CaGV granulin的相似性分析

应用Clustalxl.81软件比较新测定的CaGV granulin与较为典型的6种GV的granulin基因的相似区，结果见图2。这7种颗粒体蛋白基因核苷酸与氨基酸的相似性分析见表1。

核苷酸序列的相似性分析表明，CaGV granulin基因的核苷酸序列与CacGV（杨扇舟蛾颗粒体病毒）、PsGVA25-6（苜蓿绿夜蛾颗粒体病毒）、HcGVA5-1（美国白蛾颗粒体病毒）、CpGVA11-2（苹果蠹蛾颗粒体病毒）、CmGVA11-1（云杉芽卷

图1CaGV granulin基因核酸序列及推导的氨基酸序列

注： “*”表示7种颗粒体病毒完全保守的氨基酸残基；“：”表示性质相似的氨基酸残基；“.”表示弱作用残基；“-”表示插入或缺失的氨基酸残基。

图27种颗粒体病毒蛋白基因氨基酸序列的比较

表1颗粒体蛋白基因的核苷酸序列（上）及氨基酸序列（下）的相似性分析

%

项目CaCacPsA25-6HcA5-1CpA11-2CmA11-1AoS45

Ca-97.5981.8673.2981.3480.5781.33

Cac98.18-82.5273.3280.4281.3382.20

PsA25-692.7394.71-74.1383.2080.5681.53

HcA5-182.0082.3584.97-76.7274.1972.23

CpA11-295.0694.1294.5883.01-81.6081.93

CmA11-195.6896.3994.5883.0195.78-79.72

AoS4594.5596.4794.1281.7096.9995.18-

叶蛾颗粒体病毒）、AoGVS45（茶小卷叶蛾颗粒体病毒）granulin基因核苷酸序列的相似性分别为97.59%、81.86%、73.29%、81.34%、80.57%、81.33%，显示了很高的同源性；由核苷酸推导的氨基酸序列之间的比较结果也相似，CaGV granulin基因的氨基酸序列与CacGV、PsGVA25-6、HcGVA5-1、CpGVA11-2、CmGVA11-1、AoGVS45 的相似性分别为98.18%、92.73%、82%、95.06%、95.68%、94.55%。

2.3Granulin基因蛋白质的基本性质分析

2.3.1氨基酸的成分分析。

根据测定的核苷酸序列推测该基因编码166氨基酸，共有20种，由22个酸性氨基酸、18个碱性氨基酸、89个中性氨基酸组成，其中谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量最高，含量较少的是丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸（表2）。通过Compute pI/Mw对CaGV granulin基因编码的蛋白序列进行分析，等电点为5.42，分子量1.981 9×104 Da，颗粒体蛋白基本是电中性，这对于形成颗粒体保持电中性是有意义的。亲水性氨基酸70个占42.17%，疏水性氨基酸79个占47.58%，两者占整个氨基酸的89.75%，说明颗粒体蛋白基因中富含亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。

表2CaGV蛋白基因的氨基酸组成

氨基酸数目Mol∥%氨基酸数目Mol∥%

Asp84.82Asn84.82

Glu148.43Ile137.83

Lys74.22Thr106.02

Arg116.63Leu137.83

Ser95.42Ala42.41

Phe127.23Met53.01

Val106.02Cys31.81

Gly63.61Pro106.02

Gln84.82Trp42.41

His31.81Tyr84.82

2.3.2蛋白质二级结构预测。

利用SOPMA程序对翻译的氨基酸序列进行二级结构分析，具体分布见图3。

注：h代表α螺旋，e代表β折叠，t表示β转角，c代表无规卷曲。

图3CaGV蛋白基因的二级结构

由图3可知，CaGV蛋白基因二级结构较复杂，分别由α螺旋（38.55%）、β折叠（18.07%）、β转角（10.24%）和无规卷曲（33.13%）组成，其中α螺旋为主要结构。

3结论

该研究通过PCR扩增得到了分月扇舟蛾颗粒体病毒granulin基因的部分序列，针对该序列分析其核苷酸组成，根据核酸序列推测了其氨基酸序列，在此基础上利用clustalxl.81软件对典型的7种颗粒体病毒的granulin基因进行了相似性分析。结果表明，分月扇舟蛾颗粒体蛋白基因与杨扇舟蛾的相似性最高，亲缘关系最近；并对该基因蛋白质基本性质进行研究，分析了该基因编码区的蛋白组成，其等电点为5.42，分子量1.981 9×104 Da；预测了蛋白质的二级结构，结果显示，该基因的二级结构主要由α螺旋（38.55%）、β折叠（18.07%）、β转角（10.24%）和无规卷曲（33.13%）组成，其中α螺旋为主要结构。

参考文献

[1] 车永贵，张家利，朱华年.分月扇舟蛾生物学特性及其综合防治[J].吉林林业科技，2001，30（5）：18-26.

[2] 张丽红，彭建新，洪华珠.颗粒体病毒的离体复制[J].微生物学杂志，2004，24（1）：60-62.

[3] 李海霞.分月扇舟蛾颗粒体病毒病理、毒力及蛋白基因的研究[D].北京：中国林业科学研究院，2006.

[4] 王艳，马文丽，郑文岭.SARS冠状病毒的密码子偏爱性分析[J].生命科学研究，2003，7（3）：219-224.

[5] 张成岗，贺福初.生物信息学方法与实践[M].北京：科学出版社，2002.

[6] 黄韧，薛成.生物信息学网络资源与应用[M].广州：中山大学出版社，2003.

[7] 张阳德.生物信息学[M].北京：科学出版社，2004.